蛋白免疫印迹杂交技术手册

蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册蛋白免疫印迹杂交（WesternBlotWB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析昀流行和成熟的技术之一。本指南讨论WesternBlot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。A蛋白样本提取制备1细胞或组织裂解2蛋白酶和磷酸酶抑制剂3蛋白定量4电泳上样样品的准备B电泳1PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker3阳性对照4内参对照5上样与电泳C转膜与显色（WesternBlot）1胶中蛋白的检测2蛋白转膜3膜上蛋白的检测：丽春红4膜的封闭5一抗的孵育6二抗的孵育7显色D常见问题分析与解决方案附录1WB实验试剂配制方法附录2SDS-PAGE胶的配制2WB概述:检测原理:3A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是WesternBlotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysisbuffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysisbuffe推荐试剂盒全细胞NP-40orRIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40orRIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）2吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask;0.5mlper5x106cells/60mmdish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30min54℃离心12,000rpm，20min（根椐细胞种类不同调整离心力）6轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5mg加入约300μl预冷的裂解液lysisbuffer，冰浴刀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（昀终的蛋白浓度至少达到0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml).44℃离心12,000rpm，20min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂4推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodiumorthovanadate配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：1.用双蒸水配制100mM正矾酸钠溶液.2.用盐酸HCl调至pH9.03.煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.4.冷却至室温5.再调pH至9.06.再煮沸至无色7.重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH9.08.用水定容至原体积9.分装保存于-20°C.溶液变黄则弃之不用.A-3蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白(BSA)作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA法。三种方法或产品比较列表如下：方法原理灵敏性干扰因素应用Lowry法Folin－酚试剂法蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系较高约5μg/ml对可达1-1500μg/ml适用于脂类含量较高的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。受硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇干扰耗费时间长40～60分钟；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差5Bradford法考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm吸收峰，在一定的范围内与蛋白质的含量呈线性关系高约1～5μg/ml,微孔法测定范围为1-25μg/ml试管法测定范围为100-1500μg/ml易受强碱性缓冲液，TritonX-100，SDS等去污剂的影响快速5～15分钟，颜色稳定；深浅随不同蛋白质变化;标准曲线有轻微的非线性BCA法BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu1+，BCA（Bicinchoninic酸）螯合Cu1+作为显色剂，产生兰紫色并在562nm有吸收峰单价Cu1+与蛋白呈剂量相关性，很高0.5-20μg/ml试管法可测范围20　2,000μg/ml微孔法为0.5～10μg/ml不易受一般浓度去污剂的干扰可受螯合剂；略高浓度的还原剂的影响较快40分钟内，较好的方法；抗干扰能力强BCA测定方法如下:A．酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号01234567蛋白标准溶液（μL）01248121620去离子水（μL）2019181612840对应蛋白含量（μg）00.51.02.04.06.08.010.02.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混刀；3.各孔加入200μLBCA工作液；4.把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5.稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混刀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；6.根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。B．分光光度计测定1.标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂孔号01234567蛋白标准溶液（μL）051020406080100去离子水（μL）1009590806040200对应蛋白含量（μg）02.55.010.020.030.040.050.02.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混刀；3.各管加入1000μLBCA工作液；4.各管充分混刀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5.稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混刀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；6.根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。A-4电泳上样样品的准备6A-4-1变性、还原蛋白样本一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer（loadingbuffer），并于95-100°C煮沸5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70°C加热5-10分钟，标准的上样buffer称为2XLaemmlibuffer，上样时与样本！：！混合后变性上样即可：2XLaemmlibuffer4%SDS10%2-mercaptoehtanol20%glycerol0.004%bromophenolblue0.125MTrisHClCheckthepHandbringittopH6.8.SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。A-4-2天然和非还原样本某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些cysteine基的氧化态，因此loadingbuffer和电泳液中不加入ß-mercaptoethanolandDTT蛋白状态凝胶状态loadingbuffer电泳缓冲液还原—变性还原和变性有ß-mercaptoethanol或DTT和SDS有SDS还原—天然还原和非变性有ß-mercaptoethanol或DTT，无SDS无SDS氧化-变性非还原和变性无ß-mercaptoethanol或DTT，有SDS有SDS氧化-还原非还原和天然无ß-mercaptoethanol或DTT，无SDS无SDS注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳7B电泳B-1PAGE胶的制备聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入过硫酸铵及DMAP或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交联度（%C），T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+b)*100%,其中:a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成昀小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis).的总量百分浓度（w/v）。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。蛋白分子量(kDa)凝胶浓度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008不同浓度的凝胶的配制方法见附录2首先配制各组分贮备液，然后分别配制浓缩胶和分离胶。B-2蛋白分子量Marker预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪商业化产品：非预染Marker(MW116,97.4,66,45,3629,24,20.1,14.2KDa)预染Marker(MW116,97.4,66,45,3629,24,20.1,14.2KDa)B-3阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。8B-4内参对照管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。内参Beta-actin抗体at1/5000dilution,Lysates/proteinsat20ugperlaneLane1:HeLanuclearLane2:HeLawholecelllysateLane3:A431celllysate