荧光实时定量 PCR 技术初探

生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences1荧光实时定量PCR技术初探张鋆（责任编辑：xmale）摘要：少量的DNA序列的准确定量曾经是一件很难很累的事情，不过realtimePCR的出现把它变为和普通PCR差不多一样容易。原理是利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR产物的动态累积，得到S型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度（时间）来间接比较（进而确定）初始模板的分子数。我们试验了标准曲线的制作，以及对免疫相关的目的基因IL-4转录水平的定量，而且用HPRT持家基因对IL-4进行归一化。结果与RT-PCR相近。灵敏度，误差降低，可重复性有望更上一层楼。关键词：realtimePCR定量荧光SYBR扩增曲线标准曲线cDNAAbstract:IthadbeendifficultandtiringtoquantitateasmallamountofDNAuntiltheinventionofrealtimePCRtechnique,whichisaseasyasregularPCR.ItproducesanddisplaysthekineticaccumulationofPCRproduct(oramplicon)----calledamplificationcurve.Assumingthatampliconsareamplifiedexponentiallyduringtheearliercycles,wemakeuseofthesimpleequationy=axtocomparethestartcopynumberofageneindifferentsamples,bymeasuringthethresholdcycle(Ct).Andwithsomestandard,copynumberofagenecanbequantified.Inthisexperimentwetriedmakingsomestandardcurves.ThenwequantifiedIL-4cDNAin3subsetsofThelpercell,normalizedbyHPRThousekeepinggene.TheresultcorrelateswithRT-PCR.However,sensitivity,deviationandprecisionstillneedtobeimproved.Keyword:realtimePCRquantitationfluorescenceSYBRGreenIamplificationcurvestandardcurvecDNA收稿日期：2003-10-10；接受日期：2003-10-15作者简介：张鋆，生物技术专家。生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences21前言1.1发明荧光实时定量PCR，由美国应用生物系统公司（AppliedBiosystems）在1996年发明。除了realtime(quantitative)PCR，有人也称它为kineticPCR。顾名思义，它不单指数性扩增（已知部分序列的目的）DNA，而且通过检测每个循环PCR产物的总累积量（借助荧光标志），可以达到很好的定量结果。1.2原理（1）PCR：Polymerasechainreaction.是体外模拟生物的DNA复制。需要DNA聚合酶，DNA模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs(dATP,ACTP,dGTP,dTTP),以及适当的缓冲体系。PCR产物的增长形式为２N(如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N是循环数)。实际中，扩增效率不为100％。RealtimePCR是定量PCR的一种，当然是在PCR的基础上发展出来的。（普通）PCR包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而realtimePCR主要利用的是扩增曲线（amplificationcurve）,循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以考虑。普通PCR是在扩增完以后，（无论多少个循环），进行电泳，染色。对于判断目的DNA有没有，是出色的。但对于检测目的DNA有多少分子（初始的时候），则勉为其难。因为PCR的理想和实际仍相差一段距离。理论界普遍认为，PCR的起始若干循环内，由于原料，酶的充足，抑制子（抑制PCR的因素，如图1：ABIGeneAmp5700全套设备。组成：热循环仪，荧光检测器，电脑。生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences3dNTPs分解产生焦磷酸）的量少，PCR可以是理想的——即每个循环后扩增子增加一倍。然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，抑制子浓度也相对较高，PCR的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型的，而不是“J”型。这个扩增曲线，据说最初是用以下办法得到的：配好若干（如40）相同的PCR体系，分别进行1，2，3……40个循环，再用测OD等定量方法来知道有多少扩增子产生，作图。由于对极少量DNA(1~数千？)的直接定量办法还没有，该扩增曲线的最初若干循环，扩增子的量标为0，表示难以同背景干扰分开。RealtimePCR同样不能直接测出初始DNA的分子数，不过，它采用的数据是在PCR中期，比末期定量要准确。（更接近理想情况。）（2）RealtimePCR的化学基础realtimePCR是普通PCR的一项改进，使用了针对扩增DNA的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA的扩增曲线（如，图2，3）。图2：扩增曲线。理想：J型，2N方程。实际：S型。分为：不可检测期，指数期，平台期。S型J型生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences4常见的有2种染料。1SYBRGreenI。是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。如果PCR是理想的，扩增子就近似于体系中所有的dsDNA，那么荧光值能代表扩增子的量。然而，一定要考虑实际PCR中可能有较多模板，线性扩增产物（由一侧引物延伸到底），引物二聚体等，它们都是dsDNA，都会削减定量的准确度和灵敏度。图3：realtimePCR的扩增曲线。名词解释：•Rn:一个反应管经n次热循环后，测得的荧光强度。(NormalizedwithROX-参比染料。)•Rn+:反应管含有模板DNA。•Rn-:反应管不含有模板DNA。•无模板对照：Notemplatecontrol，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。•Threshold:荧光（Rn）超过本底——达到可检测水平时的临界数值。•Ct:thresholdcycle，临界循环数，threshold横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。•基线：baseline,是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。）图4：SYBR与dsDNA结合，并且受到激发的时候，可以发出绿色荧光。生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences52TaqMan水解探针。由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的特异核苷酸序列组成。PCR所用的DNA多聚酶常常带有5→3外切酶活性，于是延伸阶段就把探针切碎，使得产荧光基团，荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测。每一个TaqMan水解探针被切碎，对应一个荧光基团的放光，也对应一个扩增子的产生，所以，这又大大提高了定量的灵敏度。于是，任何时间点都可以测扩增子的量，即“realtime”的意义所在。荧光-DNA误差在所难免，也是一直在改进的地方。据说，由于技术和对结果的要求，实际是在每个循环的退火与延伸2步测几个值，求了平均以后显示出来——Rn。所以，它的核心就是光学装置，如CCDcamera。（3）定量理论。处理背景后，用荧光值对循环数作图，得到扩增曲线。前面10~15循环左右，因为扩增子太少，荧光强度与背景干扰无法区分，也就是同样存在baseline(Rn=0).Baseline的结束是在Rn上升为正的时候。一般有多管——多条扩增曲线，用户手册建议baseline起始为6或其它不小于5的数，终点为在最早有出现Rn0的循环数再往前几个数（severalcyclesbelowthecyclewherefluorescentPCRdetectionbegins）。图5：TaqMan探针的机理。DNA多聚酶在延伸阶段把探针切碎，产荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测。生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences6同样重要的还有低荧光值（0~1左右）的扩增曲线部分。因为这时荧光已可测，而PCR效率仍在高水平，接近指数扩增（exponentialamplification）。即使扩增效率不是100%，这段时间内也是变化不大的，可设为Ex.有指数方程：CN=C0×(1+Ex)NCN:扩增子的量。N:循环数；N=0：第零循环，初始。C0:初始模板数。为简单起见，以CN=C0×2N为例。要换为荧光值，只需乘以RS(每个扩增子产生的荧光量)。(CN×RS)=（RS×C0）×2N→RN=R0×2N.RN:理论上N循环后的绝对荧光值，不考虑背景。它不等于Rn——normalizedreportfluorescence，去除背景以后的荧光值。在图中的荧光值区域划一条水平线，如图：表示把荧光值（RN）固定,那么R0与N的关系也固定。即，R0=RN/2N→图6：realtimePCR利用扩增曲线的指数期来定量，并且重在横轴。不同的初始DNA经不同的循环数到达同一个Rn值（荧光阈值，threshold）。阈值定在指数期，所以可以根据指数方程来分析临界循环数和模板初始量。普通PCR包括RT-PCR是终点定量的办法，相当于划一条竖直线，以Y轴（EB胶染或SYBR胶染）做比较；竖直线的位置也就是设多少循环是要摸索的；如果值都在指数区，则准确性应该可以。生命科学趋势2003年12月第1卷第4期TrendsinLifeSciences7Log10R0=Log10RN－Log102N→Log10R0=constant－N×Log102=－0.3010N+constant(constant:某个无关紧要的常数)或者，N=－3.322Log10R0+constantN：这里为达到荧光值RN所需的（对应的）循环数。如果2个管（2条扩增曲线）达到同样RN的N(N1,N2)相差1（N1－N2=1），则Log10R0，1－Log10R0，2=－0.3010×（N1－N2）=－0.3010→R0，1/R0，2=1/2,即管1内模板初始数量为管2的1/2。于是，DNA量的比较转变为循环数（时间）的比较。如果这2管DNA的初始量都未知，那么现在至少他们的相对量是已知了。如果其中一管DNA已知浓度（或量），那么另一管就被定量。如果本来2管DNA都是已知浓度，那么它们可作为对realtimePCR的校验。其实，PCR的效率常常不为100%。那么如何作定量呢？（无论相对或绝对。）——标准曲线法标准曲线法是一种通用的方法，用于得出实际的模型（方程），待测样品经此而得到定量。这儿的标准曲线也是直线，只是斜率不一定为-3.322（从：N=-3.322Log10R0+constant）。R0与C0一致。设好的RN固定值称为threshold,N又称thresholdcycle(Ct)。所以，一般使用——理想：Ct=－3.322×Log10C0+constant实际：Ct=Slope×Log10C0+InterceptSlope:斜率Intercept:截距一系列（相对）浓度的标准品与待测样品要在同一批做real