SDS-PAGE凝胶电泳操作

SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1.30%聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH8.8Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15gTris，用1mol/LHCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3.1.0mol/L，pH6.8Tris-HCl分离胶缓冲液：12gTris，用1mol/L调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4.10%SDS溶液：10gSDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5.10%AP溶液：0.1gAP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6.1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mMTris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH8.30；7.染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8.脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9.固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10.2×SDS-PAGE上样缓冲液：10%SDS0.4ml，0.375MTris-HCl（pH6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1%溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。二、样品的处理1.蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。（2）液体样品液体样品经离心后，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。2.蛋白含量相对较高的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液用于电泳实验。（2）液体样品液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。3.未知样品对未知样品进行归类（是否为酶制剂，是哪一类酶），根据已知电泳图谱确定该类物质能跑出清晰电泳条带的蛋白浓度范围，在对未知样品进行电泳实验前，测定其蛋白含量，根据其结果进行适当处理。三、凝胶的配制1.设备检漏将电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板间注满蒸馏水，静置15-20min，观察是否有水浸出，若无则进行下一步操作，反之，则拆除进行重新安装，并重复检漏至无液体浸出。注：如样品数量不多，一块凝胶板就已足够，则另一边使用凝胶隔板，防止跑胶时短路。2.分离胶的制备根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围如下表蛋白质分子量范围（KD）适宜的凝胶浓度（%）100830-1001010-30121015将检漏的蒸馏水倒出，按下表进行SDS-PAGE分离胶的配制（使用凝胶试剂盒）电泳凝胶浓度试剂8%10%12%15%H2O（ml）4.634.03.32.330%Acr-Bis（29:1）（ml）2.673.34.05.01.5mol/LTris.cl（pH8.8）（ml）2.52.52.52.510%SDS（ml）0.10.10.10.110%AP（ml）0.10.10.10.1TEMED（μl）4444总体积（ml）10注：如室温高于30℃，可适量减少TEMED30-50%，防止胶过快凝结；如室温低于20℃，可适量增加TEMED30-50%，防止胶过慢凝结。常用分离胶的浓度为10%。按上表进行配制，所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，迅速进行注胶，注胶过程要平稳，避免产生气泡，注胶完成后用蒸馏水进行水封（水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡，且防止氧化），凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。3.浓缩胶的制备分离胶制备完成后，静置60-90min，确保分离胶凝结完全后，倒出水封液体并用滤纸把剩余的水分吸干，按下表进行SDS-PAGE浓缩胶的配制。试剂浓度（5%）H2O（ml）4230%Acr-Bis（29:1）（ml）10.51.0mol/LTris.cl（pH8.8）（ml）10.510%SDS（μl）804010%AP（μl）6030TEMED（μl）84总体积（ml）63所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳（样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平），静置40-60min。4.制样吸取经预处理后样品25μl与25μl上样缓冲液混合均匀后，于沸水煮3-5min去掉亚稳态聚合，冷却后4000rpm离心4min。5.上样浓缩胶凝结后，向上槽内倒入适量电泳缓冲液，拔出样梳（要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果），向每孔内加样10μl（加样时移液枪要始终竖直，且加样迅速，为避免边缘效应，最好选取中部孔注样）。6.跑胶加样完成后，在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，连接好冷凝水，接通电源，进行电泳，稳压90V，电泳90min左右，进入分离胶后，电压改为120V，待溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。7.凝胶板剥离与固定电泳结束后，取开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内（剥胶时要小心，将凝胶保持完好），用蒸馏水小心清洗1-3次，加入固定液进行固定40-60min，倒出固定液，蒸馏水清洗3-5次。8.染色固定清洗结束后，倒入染色液，染色40-60min。9.脱色染色结束后，蒸馏水清洗3-5次，倒入脱色液进行脱色，30-60min后更换1次脱色液后，脱色至蛋白条带清晰即可。10.清洗电泳结束后，将电泳玻璃版及烧杯仔细清洗，并用蒸馏水进行漂洗后，将电泳所用物品归置原位。