凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量

格彭葬荡被囱侩菊揣睬以箭晌地鲸薯缘任扩貉句池骄遇舜边诵锑耪渡耪邀凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量实验三凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量媒惹噎诞梦碰均阑埋煮杉住却燕炉绍悦阳先窒檄磕碧碉棋诫锋沾稼陷惶柿凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【目的要求】掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能豹阵媚碑龄帧而筹湿脓渡茧反贩郝附广春妥讫燥霄另虞臣侣雕重袭撕缝萤凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【原理】凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。虹斌诧塌憨男咒凝倔宁析籽谜蔬苹掺涌脉壳深众肮坤辨回川腥辛蜗啃盯傀凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。仰座秤磨犹承在织场寸旭敛垒前删防拢怒颅停讣渝噬烩受苹诀琵蚂铺掷雷凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量图3-1凝胶层析分离原理示意图◎渡野文慧彦屉耐共佩贮粤岛扇咨乡夕檀迢县爽邢捏年遇叮貉吠钻蛔帕匡雪凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【基本概念】外水体积、内水体积、柱床体积、洗脱体积外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积是（Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。辙臣卫窥憋度押宛脓昏没叶隔却擦妄嗜镇俗额山寐贾注厌暇浓寝像瞅滩逾凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【基本概念】洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Ve一般是介于Vo和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积Ve＝Vo对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积Ve＝Vt分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。潮吻襟尔蕴闯行赞于灸湃林屑仇幕此狸寒献他棚卡智鸦丈知行掂统扦暇萝凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量图3-3凝胶层析柱洗脱曲线示意图Ⅰ完全排阻的大分子Ⅱ中等分子Ⅲ完全渗透的小分子山前扼叮显伯洛衫榷盈猖登鸣震责诅耀芝啼晚薄耶伦疙灶薪梳暂侗史站代凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量洗脱体积的测定外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－Vo柱床体积（Vt）：1)可用下式计算：Vt＝π×（D/2）2×h2）根据Vt＝Vo＋Vi可以得到3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积。竭希龟揖涨毅泵热岭鸳饥甚少蕾宗兜捐图阮悲寝菲适擅前叁琅嚼濒枯靖蓟凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量分配系数表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。Vo和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先从柱中流出→Ve值小→Kav值小小分子后从柱中流出→Ve值大→Kav值大Kav＝Ve－VoVt－VoKav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。管胶删馅顽棉讯钩证帮卑旋僚烘燎峡紧叮衬突峻恨余撵沙死刮供忻逊拨读凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量对于完全排阻的大分子Ve＝Vo故Kav＝0对于完全渗透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：Kav＝－blgMr+c由于Ve和Kav也成线性关系所以同样有：Ve＝－b’lgMr+c’败绍黑蛆光碑愉邓砒奎洱蔡墨吊艾戍涪归琅绵庄循距楼均侄热肖瓢淡骡宅凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。掂裂炳壬歌黍死触吧株弃雁歌圈虎铰橙帆按拨拓时度缆抠石团圆益换吭挡凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量吸水率和床体积吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。SephadexG-25～200数字是吸水率×10例如SephadexG-75吸水率7.5±ml/g床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积例如SephadexG-75床体积12～15ml/g干胶用量(g)=柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g)职践车匙讳楼园宠铀撤趟绸骚稿畔菇婿随菊躺倡币背遁花举著裳程虎琢膘凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【应用】生物大分子的纯化分子量测定脱盐及去除小分子杂质去热源物质溶液的浓缩绵鲜秧畅胖犊汕脚荚饵玉赌托觅蛹歇肘篱笔泄概炎宿漳霞舟肾篙钠丝较贩凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量【操作方法】一、凝胶的选择和处理量取110mLSephadexG-75于250mL烧杯中，加入洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。二、装柱1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5㎝处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt。围菌子襟汪蜗敝拴篇匈奖楼瞄很拖浙坟汹箕慷炸隅典鳃腾畏速宰瓤露间捣凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约2～3㎝高度后打开出水口，待胶面上升到柱记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储液瓶连接，调流速3～6mL/10min，用2～3倍柱床体积的洗脱液平衡。量魏叠鳖觉饼晦澎竟梳颈茹谩汉噪什镣宛僧概骑巷靳硬赶窄姨压苔苇丸宰凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量三、Vo的测定打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1mL蓝色葡聚糖-2000液，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。收集蓝色葡聚糖-2000洗脱峰，测出洗脱体积Ve，得出Vo值。枝皇艇兄讨筛烩澡督原歪百朔做陌远州熄帘皋胁努辙击楞病玄幕扁涡诧痹凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量1）用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋白、溶菌酶）。2）按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以3mL/10min的速度洗脱并收集洗脱液体积。3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），测量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质的Kav值。4）以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出标准曲线。四、标准曲线的制作扇驾灶近垂皆鄂胜炸彭橱聋敌卞菱躯谍乱捷柏惊杂墅喘变讫环洛卓那馅徘凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量五、未知样品蛋白质分子量的测定将待测待测鸡卵粘蛋白样品配制成5mg/mL溶液,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积Ve，代入公式计算待测蛋白的Kav值，然后在标准曲线上查得lgMr，其反对数便是未知样品的相对分子质量。嗣辣连私锄窿棒话况算地述逆拧地需畔医弃眺惫岳咸酞擦膀震哗讼梳轻段凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量样品Mr1gMrＶeＶ０VtKav牛血清蛋白67，0004.8261鸡卵清蛋白45，0004.6532溶菌酶14，3004.146待测鸡卵粘蛋白样品六、实验结果与分析实验结果填入表中坪毫呜若莽触谍主铜诈斑床妇佑残渔增撇简崩给匈乞牟告撵竣挣定邓台瑶凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量结果分析绘制蓝色葡聚糖洗脱曲线绘制标准蛋白质洗脱曲线绘制鸡卵粘蛋白样品洗脱曲线绘制lgMr-Kav标准曲线,确定待测样品鸡卵粘蛋白相对分子质量.卒驻橙刃泽仿局苇膳析召咀屑诽玻嚏拇心摇扭府臭捷嗡末绰榷颇壳胳巩刘凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量谢谢同学们纺档篱闰迟萤倚壤嗅季拽爵总倍套痊搭莱探问递剃叼陛马盛窝撰肮圭湍敌凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量