驴精液常温保存的研究

新疆畜牧业新疆畜牧业2014年第11期中图分类号：S822.3+4文献标识码：B文章编号：1003-4889（2014）11-0014-03驴的全身都是宝，驴肉蛋白质含量高，富含必须氨基酸；驴奶基本物质含量与牛奶接近，维生素含量高，为牛奶的4.75倍，必需氨基酸含量比牛、人乳高，微量元素充足，钙、硒丰富，属于富硒食品；驴皮胶（阿胶），具有补气补血、益肾强筋功效，是我国传统中药材，其药用价值已经得到了充分的认可；驴血清是驴产品中的珍品，可以生产预防多种疾病的生物制品；驴的脏器（驴肾、驴鞭）有很高的药用价值，可以治疗阳痿、骨结核、骨髓炎、缺乳、虚劳、心烦等多种病症。我区具有丰富的驴资源，随着科技的发展，驴的特色资源逐渐被人们发现和利用，驴肉加工及产品开发的市场广阔。市场需要带动了养驴业的升温，新疆养驴业有很大的发展空间，已成为南疆各地州广大农村一个新的经济增长点，带动更多的农牧民科学养驴，走低投入，快出栏之路，培育出更多高品质、高产肉量的新型驴品种，因此养驴业的发展将有很大的前景。随着养驴业的不断发展，选择优良的种公驴的精液提高驴群的品质和繁殖率，对驴业的发展有重大的意义，现在各种家畜人工授精技术日益发展与提高，人们越来越认识到家驴生产中人工授精技术的重要性，它比传统的本交方法管理更严格，更有计划性，可以集中分娩和管理，但是不能被广泛的应用，其中一个重要的因素是精液的保存问题，由于冷冻精液不能被普遍的应用到家驴生产中，所以为使人工授精普遍推广提供了条件，人们开始研究驴精液常温保存。家畜精液的常温保存，是人工授精技术的一项重大革新，它可使精液在体外保存一段时间后再使用。驴精液常温保存的成功与许多相互作用的因素有关，如稀释液种类、成份及添加方法，如今大量研究的目的是寻求能确保获得保存后较高活率、生化完整性和精细胞膜稳定性等一些因素的“最佳”组合。液态保存是将精液保存在一定的变动幅度的温度下利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动，减少其能量的消耗，使精子在保持可逆性的精液静止状态而不丧失受精能力，因此，所有稀释液和保存环境的主要作用，都是为了给精子提供足够的营养物提供其代谢所需的能量；防止精子迅速冷却；进行缓冲以防止pH值的变化；维持适当的渗透压，平衡电解质，引致细菌的生长；扩大稀释倍数来增加输精支数。1常温保存的原理驴精液常温保存技术在繁殖控制和现代畜牧生产中日益显示出其重要性。另外，随着我国养驴业的快速发展，人工授精技术的广泛推广，驴精液稀释液已被广泛运用。目前，驴精液稀释液种类很多，国收稿日期：2014-07-22作者简介：古丽海霞（1971-），女，哈萨克族，大学本科，畜牧师，主要从事草原保护与建设工作。驴精液常温保存的研究古丽海霞1，高斐2（1.富蕴县草原监理所，新疆富蕴836100；2.伊吾县畜牧兽医局，新疆伊吾839300）摘要：驴精液常温保存技术在繁殖控制和现代畜牧生产中日益显示出其重要性。另外，随着我国养驴业的快速发展，人工授精技术的广泛推广，驴精液稀释液已被广泛运用。目前，驴精液稀释液种类很多，国内许多学者对稀释液作了大量研究[1]，但保存效果各有差异，且条件不一，稀释液多为现用现配取用操作不方便。所以为了易于推广，药品价廉易得，保存效果好，现对简单易行的常温保存稀释液进行了探讨研究。关键词：驴精液；常温；保存142014年第11期内许多学者对稀释液作了大量研究[1]，但保存效果各有差异，且条件不一，稀释液多为现用现配取用操作不方便。驴精液常温保存时的稀释液应该能减弱精子运动[2]，抑制代谢，延长体外存活时间，扩大精液体积，提高精液利用率。一般稀释液有营养剂和保护剂两部分组成：营养剂是构成驴精液稀释液的主要成分，这些成分主要包括营养性的糖类，如葡萄糖、乳糖、蔗糖等，为精子在体外生存提供养分，供给精子营养，补充精子能量的消耗，同时，糖类与细胞膜磷脂结合置换磷脂头部周围的水，防止膜的损伤，还包括卵黄、奶类等，这些还具有调节渗透压、降低精子中电解质浓度、保护精子膜的作用。保护剂主要是由缓冲物质和其他添加物组成，常用的缓冲物质是柠檬酸。常温保存是通过增加酸度，降低精液的pH来抑制精子的代谢活动，以减少其能量消耗。酸性在一定范围内是可逆抑制，通常把pH调整到6.35左右。磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等这些缓冲物质对于中和精子代谢酸性物质和酸反应具有良好的缓冲作用。在驴精液采集和操作过程中，不可避免地带入细菌等污染物，在体外保存时间越长，微生物会过度繁殖造成精子大量死亡。抗生素如青霉素、链霉素等，主要是抑制病原微生物对精子的危害。而现在在驴精液稀释液中加入抗生素是抑制精液内细菌驴精液的常温保存，是人工授精技术的一项重大革新，它可使精液在体外保存使用。2驴精液的采集与精液评定在家畜假阴道法采精技术中，除温度外，内胎的压力因素也至关重要，压力不足不能刺激公畜射精，压力太大则阴茎不易插入，甚至可能导致阴茎损伤。公牛和公羊对假阴道的温度比压力更为敏感，而公马特别是公猪则对假阴道的压力比温度更为敏感。在驴假阴道法采精技术中，关于压力的报道不多，Bravo等的研究认为，由于驴为子宫体射精动物，假阴道内应放置一特殊的仿驴宫颈“工”型结构以刺激驴阴茎射精。表明驴假阴道法采精中，阴茎对假阴道内胎压力不敏感，但放置特殊结构，模仿子宫体射精是必要的。理想的采精方法应该具备4个条件：可以全部收集公畜一次交配射出的精液；采精方法不影响精液品质；公畜生殖器官和性机能不会受到损伤和影响；器械用具简单和使用方便。一般家畜的采精方法主要有按摩法电刺激法、假阴道法手握法等。在各种采精方法中，以假阴道法研究最多。国外假阴道采精的研究报道中，关于假阴道内胎温度的设置不同。Raymundo等设置内胎温度为42℃，Davalos等报道内胎温度为40℃，Garnica[7]等报道说内胎中加入60℃的水。国外报道的不同内胎设置温度下驴交配时间和射精量有明显差异[8]，这一差异除了与驴个体差异有关外，还与采精过程中内胎温度下降导致驴射精不全有直接关系。采精前，驴的充分诱情和爬跨训练也是采精能否成功的关键。公畜在交配或采精过程中包括求偶、勃起、爬跨、交配、射精等一系列性行为，性行为的引发是神经激素感官和外激素等因素共同作用的结果。一般运用气味吸引、声音吸引、视觉刺激以及异性刺激持续辅助等几种方法对驴进行诱情和爬跨训练。实践中，各种方法要灵活运用和综合使用，以不断增加驴性刺激强度。研究认为：公驴对发情母畜气味较为敏感，自然交配中，气味可能是驴传递性信息的主要媒介；声音刺激对驴诱情和爬跨有一定的作用；对于性成熟但没有性经历的公驴，经一定次数的训练也可能采精成功；驴有较好的记忆力，一次训练采精成功后，以后采精便不很困难；经诱情训练多次仍无爬跨行为，应放弃采精，隔一天再进行训练。2.1采精注意事项2.1.1采精时，要注意安全，特别是大家畜采精。2.1.2善待公畜，不可施暴。2.1.3公畜对假阴道的温度较敏感，应特别注意调温；将阴茎导入假阴道时，且勿用手抓握阴茎；公畜射精时间极短，只有几秒钟，当公畜用力向前一冲时即表示射精，因此，要求采精者动作迅速。2.1.4公马、驴对假阴道的压力更敏感，且阴茎在假阴道内抽动时间较长，故要固定好假阴道，并使假阴道入口端向阴茎方向倾斜施压。当公马、驴头部下垂，啃咬台畜鬐胛，臀部肌肉和肛门有节律颤抖时即表示射精，此时需使假阴道向集精杯方向倾斜，以免精液倒流。2.2精液品质的评定2.2.1射精量：将采得的精液倒入有刻度的试管或杯中，测其容量。各种家畜的平均射精量为：驴50（20~80）ml，牛4（2~10）ml，羊1（0.7~2）ml，猪250（150~500）ml。2.2.2检查精子的密度：取一小滴精液于清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，但不得有气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置显微镜下放大400~600倍观察，按下列等级评定其密度。密—在整个视野中精子密度很大，彼此间空隙综述与专论综述与专论15新疆畜牧业新疆畜牧业2014年第11期很小，看不清各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升含精子数约在10亿以上。中—精子之间的空隙明显，精子彼此之间距离约有一个精子的长度。有些精子的活动情况可以清楚地看到。这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2~10亿之间。稀—精子分散存在，精子间的空隙超过一个精子长度，这种精液每毫升所含精子在2亿以下。2.2.3评定精子的活率：必须于采精后立刻在18~25℃实验室中进行，最好在37℃保温箱内进行，同时也可以测定精子的密度。用玻棒蘸取一滴原精液或稀释的精液（马、猪精液密度低不须稀释，牛、羊密度大，需用0.9%氯化钠溶液稀释，其温度相近），滴在载玻片上，也可滴在载玻片上翻放于凹玻片的凹窝上，最后置于显微镜下，放大250~400倍检查，显微镜载物台须放平，并最好在暗视野中进行。精子的活动有3种类型：前进运动、旋转运动和振摆运动，评价精子活率是根据前进运动精子数多少而定。2.2.3.1精液外观检查颜色：驴正常的精液一般为淡乳白色或浅灰白色，如果颜色异常，则为不正常现象。气味：公驴的精液略带腥味，如有异常气味，可能是混有尿液、脓液尘土、粪渣或其它异物，应废弃，色泽与气味检查可以综合进行。精液pH检查：取精液0.5ml，滴上0.05ml的溴化麝香兰，充分混合均匀后，置于比色计比色，从所显示的颜色便可测知pH。驴精液pH为7.4~7.5。2.2.3.2精子活力检查精子活力是指精液中呈前进运动精子所占的百分率。由于只有前进运动的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以活力与母畜受胎率密切相关，从而使它成为目前评定精液品质优劣的常规检查的主要指标之一。3稀释液对驴精液常温保存效果的影响卵黄：自Phillip和Lardy等（1939）证实卵黄有利于精液保存之后，卵黄便成为精液稀释液的主要成分。卵黄有维持精子活力、保护精子顶体和线粒体膜的作用；卵黄还是一种“渗透性缓冲剂”，使精子能耐受低渗和高渗；卵黄在冷冻过程中能附着在精子膜上，而对精子有保护作用，卵黄具有保护性能是由于其脂蛋白的浓度较低。Salamon等（1968）证实，颗粒冻精卵黄浓度以15%为宜。但是，卵黄对精液也有不良的影响，即在有氧的条件下，卵黄的某些氨基酸经酶的作用后，可能产生对精子有害的过氧化氢，因此，在精液稀释液中，加入适量的过氧化氢酶则能改进精子的存活能力。而抗冻剂中的卵黄属于大分子膜外保护剂，与甘油配伍可发挥膜内外协同保护作用[11]，卵黄具有抗精子“温度休克”的作用，可提高复温后精子存活率和致孕率。糖类：关于猪冻精稀释液成分很不统一，但其中使用较多的仍是糖类。李震钟等研究表明，在猪冻精稀释液中添加2%~4%的葡萄糖效果较好，浓度过高时对精子顶体有损害作用。Paulenz等研究发现添加乳糖的效果比蔗糖和果糖好。李青旺、王立强等[13]认为，低浓度的葡萄糖（2%~3%）与乳糖（2%~3%）混合使用效果较好。而英国剑桥大学则用7.76%葡萄糖稀释液中的添加物质。EDTA：乙二胺四乙酸，在牛精液冷冻稀释液中，添加许多物质，如EDTA，其冷冻的效果很好。因此有人把它引入猪精液冷冻稀释液，在前德国和前苏联应用的效果都令人满意。但也有研究人员的试验证明，猪精液中加入EDTA，其效果不如牛精液中明显。4驴精液常温稀释液制作迄今为止，驴的人工授精还没有推广，而对驴精液的常温保存技术也才在实验阶段，还没有用自行研制的驴常温稀释液制作的精液应用于实际生产的。优质稀释液是影响精液保存效果的重要因素之一。葡萄糖稀释液是20世纪70年代我国用于猪人工授精中的主要稀释液。糖类具有保护精子的作用，Nauk等人发现糖类可以稳定细胞膜蛋白质-脂质复合性能[14]。在常温保存中，不同种糖的配合使用比单一使用效果好。aulenz等研究发现添加乳糖的效果比蔗糖和果糖好。李青旺、王立强等[13]认为，低浓度的葡萄糖（2%~3%）与乳糖（2%~3%）混合使用效果较好。而英国剑桥大学则用7.76%葡萄糖稀释液中的添加物质。柠檬酸钠和EDTA的加入可充当酸性缓冲物质。用明胶