生-物-技-术-概-论..

生物技术概论东北农业大学生命科学学院李杰绪论一、生物技术的定义生物技术(biotechnology),也称生物工程(bioengineering)，是指人们以现代生命科学为基础，接合先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品。生物技术是有多学科综合而成的一门新学科。二、生物技术的种类及其相互关系生物技术主要包括以下5项技术：1.基因工程（geneengineering）2.细胞工程（cellengineering）3.酶工程（enzymeengineering）4.发酵工程（fermentationengineering）5.蛋白质工程（proteinengineering）1.基因工程（geneengineering）基因工程是70年代兴起的一门新技术，其主要原理是应用人工方法把生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物。也称DNA重组技术。2.细胞工程（cellengineering）所谓细胞工程是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、反之，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用物质的过程。包括动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术等。3.酶工程（enzymeengineering所谓酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括酶的固定化技术、细胞的固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。4.发酵工程（fermentationengineering）利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等优点，在合适条件下，通过现代工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程，也称微生物工程。5.蛋白质工程（proteinengineering）是指在基因工程的基础上，接合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。这5项技术是互相联系、互相渗透的三、生物技术涉及的学科`现代生物技术是所有自然科学领域中涵盖范围最广的学科之一。它包括分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物学、人体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗传学等几乎生物科学所有的次级学科，又结合了化学、化学工程学、数学、微电子技术、计算机科学等尖端基础学科，是一门多学科互相渗透的综合性学科。四、生物技术对经济社会发展的影响1.改善农业生产，解决食品短缺。1.1提高农作物产量及品质（1）培育抗逆的作物优良品系；（2）植物种苗的工厂化生产；（3）提高粮食品质；（4）生物固氮，减少化肥用量。1.2发展畜牧业生产（1）动物的大量快速无性繁殖；（2）培育动物的优良品系。转基因技术与转基因生物通过基因工程技术对生物进行基因转移，使生物体获得新的优良品性，称之为转基因技术。通过转基因技术获得的生物体称之为转基因生物。四、生物技术对经济社会发展的影响2.提高生命质量，延长人类寿命（1）开发新型药品（2）疾病的预防和诊断（3）基因治疗（4）人类基因组计划（HGP）3.解决能源危机，治理环境污染（1）解决能源危机（2）环境保护4.制造工业原料，生产贵重金属（1）制造工业原料（2）生产贵重金属五、发展生物技术的重要性1.生物技术是解决全球性经济问题的关键技术。2.生物技术促进传统产业的技术改造和新兴产业的形成，对人类社会生活将产生深远的革命性的影响。生物技术将是21世纪高新技术革命的核心内容，生物技术产业将是21世纪的支柱产业。第二章基因工程基因工程的基本含义：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物特性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造新的生物类型。第一节基因工程工具酶和DNA加工一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。一、限制性内切酶限制性内切酶（restrictionendonuclease）是一类一环状或线形DNA为底物，能识别DNA种特定核苷酸序列，并在合适反应条件下断开磷酸二酯键，产生具有3ُ—OH和5ُ—P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。目前基因工程中所用的是II型酶。1.限制性内切酶在DNA分子上的识别顺序限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称之为识别序列，也称识别位点。识别序列多数由4、5、6个核苷酸组成，其共同特点是呈现碱基互补对称。2.限制性内切酶切割DNA的位点和切割片段的末端II型限制性内切酶的切割位点位于识别序列区内，不同的酶切割DNA分子后所产生的末端不同。有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但切割DNA分子产生的DNA片段具有相同的末端，称之为同尾酶。二、DNA连接酶能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键，是两个末端连接的酶称为DNA连接酶（DNAligase）.现用的DNA连接酶有两种：（1）E.coliDNA连接酶；（2）T4DNA连接酶三、DNA片段末端修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶2.核酸外切酶3.碱性磷酸酶第二节基因克隆载体一般而言，外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，把这种能承载外源DNA片段(基因)带入受体细胞的传递者称之基因克隆载体(genecloningvector)。作为基因克隆载体至少必须具备3个条件：(1)具有能使外源DNA片段组人的克隆位点。(2)能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。(3)必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。一、质粒载体质粒载体是最早发展起来的一类基因克隆载体，以质粒DNA为基础构建而成，是微生物和植物转基因研究的主要载体。质粒是细胞中染色体外的裸露DNA分子，广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。一个质粒就是一个DNA分子，多数以超螺旋环状共价双链分子形式存在，以ccDNA表示，体外在理化因子作用下可成为开环或线形分子。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型复制的质粒。至今已构建了不下几百种的质粒载体，现举例如下：1.pBR3222.pUC18/19二、噬菌体和病毒载体1.cosmid载体由带cos位点的λDNA片段与质粒构建的载体称之为cosmid载体。2.CaMV基因克隆载体（1）互补载体系统（2）混合载体系统（3）CaMV35S启动子融合基因载体系统第三节目的基因导入受体细胞一、受体细胞所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源nNA(基因)并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞。1.原核生物细胞原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，普遍被用作cDNA文库和基因组文库的受体菌，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。2.真核生物细胞真核生物细胞作为基因克隆受体近来已受到很大的重视。1.酵母：由于某些性状类似原核生物，所以较早就被用作基因克隆受体。2.动物细胞：也已被用作受体细胞，但由于体细胞不易再分化成个体，所以采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞，由此培养成转基因动物。不过最近通过体细胞培养出了多种克隆动物，由此可见动物体细胞同样可以用作基因克隆的受体细胞。3.植物细胞：作为基因克隆的受体细胞，有其优于动物细胞的特点，一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。由于这个原因，近年来植物基因工程发展非常迅速。二、目的基因组入克隆载体目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的DNA片段组入合适的克隆载体。为选用合适的克隆载体，必须注意以下几点：①为了使组入的目的基因能够在受体细胞中有效表达，应选用具强启动子的表达载体。②根据确定的受体系统，选用相应的克隆载体，因为用作受体细胞的不同生物类型有各自适用的克隆载体。③选用的克隆载体应是便于同含目的基因的DNA片段进行连接。根据实验设计，有了合适的克隆载体和含目的基因的DNA片段，则选用限制性内切酶切割，并用DNA连接酶连接，得到预期的重组DNA分子。三、重组DNA分子导入原核生物细胞可以通过转化、转导和三亲本杂交等途径，把重组DNA分子导入原核生物细胞。1.转化携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进人受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程称为转化(transformation)。DNA转化大肠杆菌的技术路线包括制备感受态细胞和转化处理。感受态细胞指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。2.转导通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程称为转导(transduction)。含目的基因的DNA与噬菌体(病毒)载体的重组DNA分子导人受体细胞，一般先须进行体外包装。为此，根据λ噬菌体体内包装的原理，获得了分别缺D蛋白和E蛋白入噬菌体突变株的两种溶源菌。这两种溶源重菌单独培养，因各缺一种包装必备的蛋白质，所以体内即使有λDNA也不能进行包装，因此细胞内积累了大量除一种以外的其他供包装用的蛋白质。如果在试管内混合两种溶源菌合成的蛋白质，D蛋白和E蛋白互相补充，就可以包装λDNA或重组的λDNA。3.重组重组DNA分子通过三亲本杂交转化大肠杆菌当重组DNA分子不能直接转化受体菌时，可采用三亲本杂交(triparentalmating)转化法。被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌和含广泛宿主辅助质粒的辅助菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体茵细胞内，按照重组DNA分子携带的选择标记筛选克隆子。四、重组DNA分子导入真核生物细胞由于真核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。近年来经过探索，发展了多种适用于植物和动物转基因的方法。1.重组DNA分子导入植物细胞（1）用根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法含有Ti质粒的根癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分(T-DNA)可以导人植物细胞，整合到植物基因组中，随其复制而复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的基因的DNA片段重组，导入根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共培养法和悬浮细胞共培养法，通过根癌农杆菌介导进入植物细胞。用根癌农杆菌介导法已获得了一些转基因植物，但是一般局限于双子叶植物。1.重组DNA分子导入植物细胞(2)重组DNA的直接转移法为克服致癌农杆菌介导法的受体局限性，近来发展了电穿孔法、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法和花粉管通道法等，把重组DNA分子直接导入植物细胞。微弹轰击法：金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。此方法可直接处理植物某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。电穿孔法细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。所以当移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。根据这一性质，植物原生质体同外源DNA分子混合，置于电击仪的样品室中，按预定的参数进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。为避免制备原生质体和原生质体