微生物的鉴定(精)

微生物的鉴定微生物的鉴定实验3-1微生物的形态观察实验3-2细菌特殊结构的观察实验3-3革兰氏染色法实验3-4微生物大小测定与计数实验3-5微生物的理化性能鉴定实验3-1微生物的形态观察一、实验目的1.学习微生物涂片、染色的基本技术。2.掌握微生物的简单染色法。3.熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区别。二、实验原理微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助于染色，使菌体着色以增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。实验3-1微生物的形态观察在微生物形态观察中，根据不同的种类，需采用不同的染液和染色方法。染色前必须固定微生物，其目的有二：一是杀死微生物并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法，固定时应尽量维持细胞的原有形态，防止细胞膨胀或收缩。实验3-1微生物的形态观察三、实验材料1.菌种与染料根据不同的菌种采用不同的染液，见表3-1和附录Ⅳ。2.仪器和其他用品显微镜，接种环，解剖刀，镊子，酒精灯，载玻片，盖玻片，石蜡油，吸水纸，擦镜纸。表3-1不同微生物种类所使用的染液微生物类群细菌放线菌酵母菌霉菌菌种大肠杆菌细黄链霉菌米酒酵母根霉染液番红石炭酸复红吕氏美兰乳酸石炭酸棉蓝实验3-1微生物的形态观察四、实验方法（一）细菌、酵母菌的染色染色操作程序为：涂片——干燥——固定——染色——水洗——干燥——油镜观察。1.涂片取干净载玻片，于中央加蒸馏水一小滴，将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后，取试管斜面一支，按无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不要挑破培养基)，涂在载玻片水滴中，涂面约为1cm2的均匀薄膜。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液1～2环涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过程见图3-1。实验3-1微生物的形态观察图3-1无菌操作及做涂片的过程实验3-1微生物的形态观察2.干燥将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。3.固定手执涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通过火焰2～3次，使菌体固定于载玻片上，待载玻片冷却后，再加染料。4.染色将涂片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位，染色1～2分钟。5.水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。6.干燥和镜检让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。实验3-1微生物的形态观察（二）放线菌、霉菌的染色1.制片及染色用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一起挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层，然后将载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热，使培养基融化，冷却后，在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸石炭酸棉蓝染液，再轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。2.镜检先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。五、实验报告绘出所观察到的各种微生物的形态。返回实验3-2细菌特殊结构的观察一、实验目的1.掌握芽孢染色的方法；2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。二、实验原理细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。实验3-2细菌特殊结构的观察细菌的鞭毛极细，其直径通常为10～20nm，只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染料之间的亲和力弱，不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。实验3-2细菌特殊结构的观察三、实验材料1.菌种根据观察目的的不同，选用不同的实验菌种，见表3-2。2.染料及试剂孔雀绿染色液，硝酸银鞭毛染色液，黑色素水溶液（见附录Ⅳ），番红溶液，甲醇。3.仪器和用品显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯等。表3-2细菌特殊结构观察所选用的菌种观察目的芽孢鞭毛荚膜实验菌种枯草芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌褐球固氮菌实验3-2细菌特殊结构的观察四、实验方法（一）芽孢的染色1.涂片取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固定。2.初染加3～5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上，用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本干涸。3.水洗待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为止。4.复染加番红液1滴，染色1min，水洗。5.镜检干燥后用油镜观察。实验3-2细菌特殊结构的观察（二）鞭毛染色1.菌种的准备冰箱保存的菌种要连续移种1～2次，取新配制的营养琼脂斜面接种，28～32℃培养10～14h。2.载玻片的准备玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。3.菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。实验3-2细菌特殊结构的观察4.制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37℃温箱)自然干燥。5.染色涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。6.镜检干后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。实验3-2细菌特殊结构的观察（三）荚膜染色1.制片在载玻片一端加一滴无菌水溶液，取少许培养72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌悬液，取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片，将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，风干。2.固定用纯甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇，文火干燥，勿使玻片发热。3.染色滴加番红溶液，染色1～2min，细水流适当冲洗，自然干燥。4.镜检背景黑灰色，荚膜呈一清晰透明圈，菌体红色。实验3-2细菌特殊结构的观察五、实验报告1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。返回实验3-3革兰氏染色法一、实验目的1.了解革兰氏染色的原理。2.掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌分为两大类，菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。实验3-3革兰氏染色法其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙酮）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔径缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色。实验3-3革兰氏染色法三、实验材料1.菌种大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。2.染料和器材显微镜，载玻片，草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液（见附录Ⅳ），95%乙醇，番红染液，香柏油，二甲苯，擦镜纸。实验3-3革兰氏染色法四、实验方法1.涂片挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三区”涂片法：在玻片中央偏左和偏右方各加一滴无菌水，先挑取少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左右一方分别涂片后，再将左右方的菌液延伸于中间区，使大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相互混合。2.干燥室温自然干燥。3.固定涂面朝上，在火焰上过2～3次。实验3-3革兰氏染色法4.染色(图3-3)(1)初染加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色1～2min，水洗。(2)媒染滴加卢戈氏碘液冲去残水，覆盖约1min，水洗。(3)脱色斜置玻片于一烧杯上方，并在载玻片背面衬一白纸，滴加95%乙醇脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5min)。立即用水洗净乙醇，并轻轻吸干。(4)复染加番红染液一滴染色2min，水洗。实验3-3革兰氏染色法实验图3-3革兰氏染色程序1.加草酸铵结晶紫染1～2分钟；2.水洗；3.加碘液媒染1分钟；4.水洗；5.乙醇脱色约30s；6.水洗；7.番红复染约2分钟；8.水洗。实验3-3革兰氏染色法5.干燥先用吸水纸轻轻吸干，再晾干。6.镜检先用低倍镜找到物像后，用油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。五、实验报告简述观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图（说明各菌的形态、颜色和革兰氏染色反应）。返回实验3-4微生物的大小测定与计数一、实验目的1.了解用测微尺测定微生物大小的方法；2.了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。二、实验原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形的玻片，在载玻片中央有一条把5mm长度刻成50等分或把10mm长度刻成100等分的线(图3-2)。实验3-4微生物的大小测定与计数测量时，将其放在接目镜隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物像。目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数的不同而异。即目镜测微尺上的刻度只是代表相对长度，所以在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的长度。镜台测微尺是一个中央部分刻有一条长为lmm刻度的载玻片(比一般载玻片厚)，其上镶有一圆形玻片，其中lmm的刻度被精确等分为100小格，每格长0.01mm(图3-3)。因此长度固定不变，所以用镜台测微尺的已知长度，在一定放大倍数下，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度(图3-4)。实验3-4微生物的大小测定与计数图3-2目镜测微尺图3-3镜台测微尺图3-4镜台测微尺校准目镜测微尺情况实验3-4微生物的大小测定与计数血球计数板可用于计数一定体积内的微生物个体数量。血球计数板是一块特制的载玻片，玻片上有4条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央lmm2面积上刻有400个小方格(见图3-5)。实验3-4微生物的大小测定与计数图3-5血球计数板的构造1-盖玻片2-计数室实验3-4微生物的大小测定与计数血球计数板有两种规格，一种是将lmm2面积分为25个大格，每个大格再分为16个小格(25×16)。如在血球计数板上刻有一些符号和数字(见图3-5a)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格：即0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；(1/400)mm2表示计数室面积是lmm2，分400个小格，每小格面积是(1/400)mm2。另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3(10-4mL)的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出lmL菌液所含的菌体数(见图3-6)。实验3-4微生物的大小测定与计数图3-6两种不同刻度血球计数板的构造实验3-4微生物的大小测定与计数三、实验材料1.标本酿酒酵母，