第14章-多倍体与转基因动物

第14章多倍体与转基因动物14.1多倍体动物动物多倍体比较少，原因：（1）高等动物远源杂交能力很弱，很难形成杂种个体；（2）多倍体动物高度不育，染色体异常通常会千万胚胎死亡，很难得到多倍体后代。但低等脊椎动物如鱼类、两栖类和爬行类中存在。14.1多倍体动物多倍体水产动物的研究目的（1）提高生长速度（2）控制过度繁殖（3）延长寿命（4）改善品质（5）合理开发渔业资源14.1多倍体动物多倍体培育在动物遗传育种上具有重要意义例如：•三倍体鲍鱼具有不育性，其性腺发育程度应低于二倍体，生长方面的能量相对增加，增强了鲍鱼的抗逆性和抗病能力，提高了生长速度和品质。•三倍体鲤鱼、三倍体牡蛎肉质更加鲜美•大麻哈鱼、鲜鱼产卵后死亡，其三倍体不育，可避免死亡。多倍体动物•鱼类精子入卵的时期是第二次减数分裂的中期，刺激卵子继续完成第二次分裂。卵中原有的二组染色体中一组作为第二极体排出受精卵成为正常的二倍体。如果在精子入卵时第二极体不能正常排出，则精卵原核结合成为三倍体受精卵。多倍体动物•如果卵子受精后，照常排出第二极体形成单倍体卵，单倍的卵原核与单倍的精原核结合就形成二倍的受精卵，这时再抑制受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体。多倍体动物•产生原理：染色体的加倍可以通过保留受精卵第二极体即抑制卵子的第二次成熟分裂或抑制受精卵的第一次卵裂来实现。1多倍体动物培育方法A物理方法机制主要是通过破坏微管形成，使由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，使染色体失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动，形成多倍体细胞。1多倍体动物培育方法（1）温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。根据处理温度的高低分为热休克法和冷休克法。一般冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围为28℃-36℃;温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0-5℃左右。•优缺点：简便、廉价，但诱导率较低。1多倍体动物培育方法（2）水静压法：采用较高的水静压（如65kg/cm2）可抑制卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。•原理：静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝即纺锤体和星体，从而暂时阻断了有丝分裂的进程。1多倍体动物培育方法•该方法处理程序标准化易于掌握，处理时间短(3-5min)，诱导率较高，对受精卵损伤较小。•但需专门的设备如水压机等。此外，静水压处理还使染色体发生了不同程度的凝缩,还可能使受精卵的结构发生某些物理和化学变化，造成发育受阻，因此在生产中应用较少。1多倍体动物培育方法B化学法•细胞松弛素诱导法：细胞松弛素B(CB)导致极体的保留是通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现的。CB处理比其他方法能更有效地诱导三倍体的形成。B化学法•6-甲氨基嘌呤诱导法：6–DMAP是一种蛋白激素酶抑制剂。当6–DMAP与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。化学法缺点：成功率较低，且对胚胎及操作者有毒性，影响存活。1多倍体动物培育方法C生物法：主要是远缘杂交法•瑞齐（Rasch）等于1965首先证明了三倍体脊椎动物可通过四倍体个体与二倍体个体杂交产生。2多倍体动物的鉴定•人工诱导处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等混合群体，所以需要筛选出需要的多倍体。2多倍体动物的鉴定（1）染色体计数法：将细胞固定制片、染色后观察染色体个数。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍是目前鉴定多倍体倍性的一种直观、可靠的方法，缺点是比较费时。（2）核仁染色观察法：一般而言，细胞核仁数量与染色体组数目（倍性）成正比例，通过银染法检测胚胎细胞核仁数量及分布情况可以鉴定多倍体，直观、可靠。2多倍体动物的鉴定（3）核体积测量法：一般而言，细胞核大小与染色体数目成比例，为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此多倍体细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。一般通过测定红细胞核体积的大小可以鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。2多倍体动物的鉴定（4）DNA含量测定：染色体组数与DNA含量成正比。测定单个细胞的DNA含量，根据细胞DNA比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。DNA含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。14.2转基因动物1.转基因动物（transgenicanimal）：是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。•利用转基因动物生产人类药用蛋白、异体器官等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之一。2.转基因动物培育方法（1）原核期胚胎显微注射法•原理：对受精卵的原核进行DNA注射，获得转基因动物。•优点：操作相对简便，技术要求相对较低，周期较短。2.转基因动物培育方法原核期胚胎显微注射法：几百KB大片段、应用广泛•目的DNA制备（无需构建载体）•DNA注入原核胚（受精卵雄核）•胚胎体外培养•胚胎移植（移植前鉴定）•发育•出生、鉴定1显微注射法受精卵显微注射胚胎移植后定检测显微注射法操作流程受精卵显微注射制备转基因动物的缺点1.外源基因整合至基因组的效率很低，对经济大动物（猴、牛、羊）的整合效率更低；2.随机整合，转基因整合的位点和拷贝数无法控制，造成转基因的表达差异很大，筛选高表达转基因动物的工作量很大；3.对经济大动物，由于需要大量的供体和受体，耗时长、费用昂贵，受到很大的限制。2.转基因动物培育方法•1980年，Gordon等人首先育成转入生长素基因小鼠。世界第一个转基因动物。•生长速度快2－4倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”发表在1982年的nature杂志上。2.转基因动物培育方法（2）胚胎干细胞方法•胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性的细胞，因此只要将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序ES细胞技术•干细胞（stemcells）：是细胞谱系分化中最原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能，能增殖分化为特定的组织细胞。•胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）：从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具有分化成3种胚层的发育潜能。ES细胞的分离培养ES细胞技术发展历史1956年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚；1958年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体；1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术；1968年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠;1970年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞；1981年，MartinEvans从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；1984年，Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为成体的各种组织，并整合入生殖系。意义：里程碑，与同源重组技术的结合使得在整体水平定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能ES细胞技术发展历史1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞；1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞；2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株……与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特的优势：（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动物生产中发挥着极为重要的作用。（3）精子载体法：精子与外源DNA混合培养，DNA可被吸收进入精子头部，然后再与卵细胞受精后发育成转基因动物。•主要问题：重复性不好2.转基因动物培育方法精子与外源DNA结合的机理精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。后来Rottman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNA相互作用形成脂质体——DNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。2.转基因动物培育方法(4)逆转录病毒载体感染法原理：当逆转录病毒的RNA进入细胞后，逆转录成DNA，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，转录出的DNA可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。逆转录病毒载体反转录病毒感染法逆转录病毒感染法特点优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝整合。缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA（≦10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。2.转基因动物培育方法（5）卵细胞显微注射法•将外源DNA克隆到逆转录病毒载体上，再显微注射到MII中期卵细胞（无核膜），再体外受精，胚胎移植，发育成转基因动物。东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆Chapter14细胞工程Copyright©2011WangWeidong,Allrightsreserved.Geneticallymodifiedanimal®fluorescentfish,thefirstgeneticallymodifiedanimaltobesoldasapet3转基因动物鉴定•目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因的存在，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交(Dotblot),Southern印迹分析等多种方法进行检测。3转基因动物鉴定•目的蛋白的鉴定：有活性的目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有：(1)SDS－聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)(2)酶联免疫吸附实验(ELISA)(3)Western印迹分析4转基因改良动物的应用（1）快速生长与肉质改善。•如转生长素基因的猪生长快，瘦肉率也高。比利时蓝牛肌肉增加表型皮埃蒙特牛肌肉增加表型美培育转基因鳟鱼：腹肌有6块,肉多15%4转基因改良动物的应用（2）增加羊毛产量和性能。•细菌基因SAT和DAS可以促进合成Cys，将该基因转入羊肠胃道上皮细胞，可提高羊毛产量。•若将毛角蛋白II中间细丝基因转入绵羊基因组中，所产羊毛光泽亮丽、毛脂含量高暖和。（3）抗冻动物品种培育。•将鱼抗冻蛋白基因AFP转入不耐寒鱼或其他动物。•一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得•例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。5转基因动物乳腺生物反应器5转基因动物乳腺生物反应器•乳腺是最理想的药物蛋白生产场所（1）概念将外源基因置于特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白的技术。5转基因动物乳腺生物反应器•1987年Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA的转基因小鼠。•2006年6月2日，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）上市获得批准。5转基因