T细胞过继免疫治疗技术的研究进展

2012年第39卷第9期·肿瘤生物治疗专栏·T细胞过继免疫治疗技术的研究进展任秀宝作者单位：天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科，肿瘤研究所免疫室，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）通信作者：任秀宝[e-mail]任秀宝教授，主任医师，博士研究生导师。现任天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗中心副主任，中国免疫学会肿瘤免疫与生物治疗分会副主任委员，中国医药生物技术协会临床应用专业委员会秘书长。2008年被评为“131创新型人才”，2009年获国家人事部“百千万人才”称号。从事肿瘤生物治疗和内科治疗近15年，在临床治疗和基础研究方面都有着卓著的成就，特别是在应用常规化疗的基础上将细胞免疫治疗、异基因造血干细胞移植免疫治疗、肿瘤疫苗治疗等现代生物治疗技术以及分子靶向药物治疗有机的结合在一起，逐步形成了个体化的肿瘤内科治疗模式。主持和参与了国家级、省部级重点课题10余项，研究成果先后获得天津市科技进步二、三等奖、中华医学科技一等奖等。发表学术论文90余篇，其中被SCI收录论文20余篇。·专栏􀳅专家笔谈·专栏寄语近年来，随着细胞生物学和分子生物学的飞速发展，生物治疗已成为继手术、化疗和放疗三大常规治疗之后的第四种肿瘤治疗模式。为进一步推动肿瘤生物治疗临床与基础研究，受《中国肿瘤临床》之邀，开辟肿瘤生物治疗专栏，与广大读者共享国内外肿瘤生物治疗的最新研究成果。专栏特邀美国Moffitt肿瘤中心教授、DonaldA.Adam黑色素瘤研究中心主任JeffreyS.Weber博士介绍了恶性黑色素瘤生物治疗领域的最新进展。还邀请中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所免疫室主任张叔人教授对新版《药品生产质量管理规范》进行解读，强调了体细胞治疗质控的重要性。以及天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗中心在细胞免疫生物治疗方面获得的一些经验供广大同道讨论和借鉴。随着肿瘤生物技术的快速发展，新的生物制品和治疗技术不断涌现，我们期待针对各种新生物治疗技术逐步建立起全国统一的技术规范和疗效评价体系，特别是在统一技术操作规程的指导下，国内各研究单位之间的多中心前瞻性随机临床研究更有意义和价值，将更有效地造福于肿瘤患者。望此专栏起到抛砖引玉的作用，与国内同道携手共创肿瘤生物治疗美好的明天。——中国免疫学会肿瘤免疫与生物治疗分会副主任委员中国医药生物技术协会临床应用专业委员会秘书长任秀宝教授中国肿瘤临床关键词过继免疫治疗T细胞基因修饰doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2012.09.001随着科学技术的发展和治疗理念的转变，以免疫治疗为基础的肿瘤生物疗法作为现代肿瘤治疗的第四种模式，越来越受到重视，应用前景广阔。相比起传统的手术和放化疗，这种方法毒副作用小、安全稳定，适应性广泛，其原理是通过利用现代生物技术调481中国肿瘤临床2012年第39卷第9期节机体的免疫功能状态，调控抗肿瘤的各个环节之间的平衡，从而达到控制肿瘤或减少治疗带来相关毒副作用的目的。临床上已有不少癌症患者通过免疫细胞治疗在生存质量和精神状态方面得到了很大的改善。目前开发的免疫治疗主要途径有三类：免疫系统的非特异性刺激、肿瘤疫苗的主动性免疫以及过继性免疫治疗。非特异性刺激治疗手段主要通过免疫刺激因子（如白细胞介素-2）或免疫抑制途径阻断剂（如抗CTLA-4抗体）的使用来上调机体免疫反应。这种手段在转移性黑色素瘤和肾细胞癌中可使大约10％～15％患者的肿瘤缩小，达到这种效果可能是由于肿瘤在免疫调节剂的刺激下提高了抗肿瘤T细胞的水平。此外，作为第二类免疫治疗途径肿瘤疫苗由于使用简单、毒副作用较小也被认为是一种很有吸引力的方法。然而到目前为止，并没有太多的临床试验结果表明这种技术的有效性。相比之下，细胞的过继免疫治疗是通过体外活化和扩增自体或异体免疫效应细胞后输注患者体内的一种治疗方法，目前被认为是最有潜力的免疫治疗手段。最近有学者应用这种方法中的TIL细胞治疗技术能够使72％的转移性黑色素瘤患者症状得到改善，其中高达40％的患者可产生完全的持久反应［1］。随着新型过继免疫治疗技术的不断发展，具有抗原特异性的T淋巴细胞免疫治疗技术越来越显示出其优越性，本文将对几种抗原特异性T细胞治疗技术的发展以及在肿瘤治疗中的应用做一综述。1肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继免疫治疗过继免疫治疗是指在体外分离并扩增具有抗肿瘤活性的自体淋巴细胞并回输宿主体内的方法［2］。用于过继转移的细胞可来自手术切除肿瘤的基质细胞或经过基因修饰表达特异性T细胞受体（TCR）的T淋巴细胞。与其他免疫疗法相比，过继性免疫治疗的优点为：首先，具有抗肿瘤能力的细胞可在体外大量扩增，这些细胞具有较高的识别抗原能力且较容易进行静脉回输。其次，这些细胞可在体外被激活，从而克服了体内一些限制其抗瘤能力的抑制性因素。第三，也是最主要的一点，在细胞回输之前可对宿主的免疫微环境等状态进行调整，如对调节性T细胞等进行干预，从而提高回输细胞的抗肿瘤效应。动物实验和对恶性黑色素瘤患者的研究均表明，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）具有一定的抗肿瘤活性。TIL是指从手术切除的肿瘤组织或转移的淋巴结中分离出来的淋巴细胞，这些TIL细胞可通过分泌细胞因子，如γ-干扰素、IL-2和肿瘤坏死因子来直接裂解肿瘤细胞。该方法最早在1988年用于转移性恶性黑色素瘤的治疗，然而由于细胞回输后在体内的活性持续时间较短而限制了其抗瘤能力［3］。2002年一种非清髓性淋巴细胞删除方案的应用，即回输前使用环磷酰胺和氟达拉滨，在宿主造血功能恢复之前的8d内消除自体循环的淋巴细胞之后，TIL才明显显现出其抗肿瘤疗效［4］，且淋巴细胞删除程度越高，治疗效果越好。最近Rosenberg等［5］开展了通过化疗联合全身照射（TotalBodyIrradiation，TBI）的方法彻底清除患者体内的免疫细胞后将体外扩增TIL回输的一项临床试验。这项试验的受试者为转移性恶性黑色素瘤患者，在使用环磷酰胺和氟达拉滨进行淋巴细胞删除的同时分别给予不同的照射剂量（2Gy和12Gy）。结果显示，化疗+TIL治疗组43例黑色素瘤患者有效率为49%；化疗+TBI2Gy+过继治疗组25例患者有效率为52%；化疗+TBI12Gy+过继治疗组25例患者有效率为72%。在参与试验的93例患者中，20例患者完全缓解，19例患者将在3～7年内达到完全缓解，5年总体生存率为29%。TIL治疗显示出了前所未有的良好效果［5］。淋巴细胞删除后回输细胞能产生疗效的原因为：首先可能是因为体内的淋巴细胞，包括一些抑制免疫反应的如调节性T细胞和骨髓来源的抑制细胞等被清除，从而促进了一些细胞因子如IL-7和IL-15等发挥作用［6］。此外淋巴细胞删除法也能促进抗原提呈细胞的活化，其由于增加了对Toll样受体刺激的敏感性［7］。Rosenberg等［5］的临床试验结果虽然意义重大，但仍需要进行前瞻性多中心的试验来反复验证其重复性、安全性及有效性。Weber等［8］在其最近关于TIL的白皮书中建议在几个重要的研究中心采用一种集中化的细胞扩增设施，统一收集标本并运输扩增后的TIL细胞，分别在几个研究中心进行回输，以达到试验的重复性和细胞的一致性。若这种方法取得成功，将极大程度的促使TIL治疗成为进展期黑色素瘤的主要治疗方法。然而，通过自体TIL回输的免疫治疗方法并不适用于所有的转移性黑色素瘤患者，如不能进行手术切除的患者，并且对其他实体瘤的应用范围也有一定的局限性。因此，对T细胞进行基因修饰的免疫治疗方法发展起来，可使有限的治疗方法用于实体肿瘤的治疗。2基因修饰T淋巴细胞的过继性免疫治疗2.1对TCR进行基因修饰的T细胞治疗T细胞受体（TCR）是T细胞表面能够识别和结合蛋白质抗原的特异性受体。当机体受到肿瘤抗原刺激时，由TCR对APC呈递的靶细胞表面抗原肽-MHC复合物进行认知来识别抗原［9-10］。以逆转录4822012年第39卷第9期病毒为载体的T细胞受体（TCR）基因转移技术十多年前首次在黑色素瘤抗体特异性TCR研究中实现［11］，这种对TCR进行基因修饰为基础的过继免疫治疗是通过基因转移技术构建肿瘤抗原特异性TCR，通过病毒载体等方法将其转入T淋巴细胞，经大量扩增后回输患者，从而发挥抗肿瘤效应的一种治疗技术。这种基因修饰的T细胞治疗方法可适用于多种实体肿瘤，在制备过程中只需鉴定出非常少量的具有抗肿瘤活性的细胞作为分离抗原特异性TCR受体的基础。一旦被整合到相应的转导载体中，就可包装出病毒后感染患者外周血T细胞并进行大量扩增，而用于多种肿瘤患者的治疗［12］。基因修饰TCR技术治疗恶性肿瘤的临床试验最早由Morgen等在2006年报道［13］，用于恶性黑色素瘤的治疗。在这项Ⅰ期临床试验中，HLA-A2阳性的转移性黑色素瘤患者接受导入MART-1基因TCR的T淋巴细胞治疗，可特异性识别MART-1肿瘤抗原的27-53表位。TCR基因转导效率为21%～72%，对CD4+和CD8+T淋巴细胞的转导程度相同，在过继治疗1年后仍可检测到基因修饰TCR的表达情况。在进行回输治疗的17例患者中有2例得到缓解，呈现出部分临床效果，并且未观察到严重的不良反应。虽然这项临床试验中患者的反应率不如TIL细胞的高（50%～70%），但这项研究为基因修饰的T细胞免疫治疗奠定了基础，带动了特异性T细胞治疗技术的迅速发展。TCR受体主要是由α和β两条链形成的异源二聚体组成，可识别肿瘤细胞表面由MHC分子提呈的肿瘤相关抗原肽。由于此种方法涉及抗原特异性TCR受体的构建，因此对肿瘤抗原的选择是该技术成功与否的重要影响因素。目前已鉴定出多种肿瘤抗原的TCR编码基因，包括识别黑色素瘤的分化相关抗原和其它肿瘤中高表达的一些肿瘤-睾丸抗原。肿瘤-睾丸抗原是表达在胎儿发育时期的抗原，它们是过继免疫治疗的理想靶抗原。这是由于随着胎儿期发育为成体细胞，这些抗原的表达逐渐消失，而只表达于睾丸组织（逃避免疫监视）和肿瘤组织中。目前已鉴定出几十种肿瘤-睾丸抗原。NY-ESO-1是肿瘤-睾丸抗原家族中的重要成员，也是迄今发现的最具免疫原性的肿瘤抗原。最近的JCO上报道了针对NY-ESO-1的TCR过继性免疫治疗的第一个临床试验［14］。这项试验对高表达NY-ESO-1抗原的11例黑色素瘤患者和6例滑膜肉瘤患者进行回输治疗，其中5例黑色素瘤和4例滑膜肉瘤患者的症状均得到改善，表现出较好的治疗效果。此外，针对MAGE-A3抗原TCR的基因修饰T细胞治疗临床试验已经开展。这种对TCR进行修饰的细胞免疫治疗效果主要取决于靶抗原的选择，适用于20%～30%的上皮肿瘤患者，该技术对于治疗其它类型肿瘤的安全性和有效性的评估也正在进行［15］。然而，TCR基因修饰治疗技术的限制性之一就是TCR识别特异性抗原的能力具有MHC限制性，如何提高TCR的亲和能力以及扩大适用范围是今后研究中需要解决的主要问题。2.2嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞治疗随着基因工程技术的发展，Gross等［16］发明了一种新的基于抗体识别原理的嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗技术，以增加抗肿瘤作用的反应性和特异性。这种方法能够产生大量针对肿瘤抗原的特异性T淋巴细胞，通过非MHC限制的方式选择性地靶向和杀伤肿瘤细胞。CAR技术的原理是将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，利用基因工程技术将肿瘤相关抗原的单链抗体可变区片段（scFv）、共刺激分子和激活T细胞的信号传导肽，通常是CD3ζ链以及与其有类似作用的FcεR1γ链连接起来，由此重组而成的嵌合性受体经逆转录病毒或慢病毒包装后将CAR导入淋巴细胞，与单克隆抗体一样特异性地与肿瘤细胞表达的相应抗原结合，然后经由信号传导肽激活相应的效应细胞，产生杀伤效应［17］。CAR技术中对抗原的要求更加广泛，并不局限于蛋白抗原，还可以包括糖类和糖脂类肿瘤相关抗原。第一代CAR只包含抗体可变区域，效应功能较弱，体内存留时间短。因此，第二代CAR在第一代的基础上增加了共刺激结构域，可延长T细胞的存活时间。第三代CAR则增加了2种共刺激分子，以期有