一氧化氮介导的细胞信号转导通路

《细胞生物学》期中综述-1-一氧化氮介导的细胞信号通路吴玉章学院生物技术基地班蒋建军0642044020摘要：一氧化氮（NO）是一种简单的双原子气体，其在生理活动起着相当重要的作用，包括血压的调控、免疫系统调控、神经系统中学习和记忆的形成等[1]。本文就NO信号分子的发现作简要介绍，并介绍NO介导的信号途径，尤其是心血管系统中的NO信号途径及其中的一些细节，包括关键的酶如一氧化氮合酶（NOS）、溶解性鸟苷酸环化酶（sGC）、鸟苷酸依赖的蛋白激酶G（PKG）的调控方式及机制。此外，总结了NO参与的信号网络途径和NO在人体生理过程中的重要作用，并举出根据NO信号途径设计的药物及其作用机制。关键词：一氧化氮NOSGCcGMPPKG简介：NO是一种极其重要的化工中间物，也可以由吸烟、汽车尾气和能源植物产生，是一种有毒的污染气体，并能破坏臭氧层、导致酸雨[2]。但是，NO是哺乳动物体内一种重要的信号分子，也是气体递质（gastransmitter）之一，其它的有CO，H2S[4,7,10]，CO和NO可以作为共递质[4]。NO在哺乳动物体内参与许多生理和病理过程。其效应既可能有利，又可能有害，需依释放量和释放部位而定。浓度水平合适的NO对于保护肝脏等器官缺血性损伤很重要。长期高浓度NO可能引发多种癌症、炎症，包括青少年糖尿病、多发性硬化、关节炎、溃疡性结肠炎。其还可以和自由基阴离子如过氧根离子（•O2-）反应形成过亚硝酸根离子（ONOO-）,损伤DNA。这样，过量的NO就可以损伤细胞。NO在活细胞中起作用的机制有几种：氧化含铁蛋白，比如核糖核苷酸还原酶、顺乌头酸酶；活化溶解性鸟苷酸环化酶(sGC)；蛋白质ADP核糖基化；蛋白质巯基亚硝基化；活化铁调控因子。NO也可以活化外周血液单核细胞的NF-κB，这是炎症反应中一个重要的转录因子。NO也是免疫系统杀伤入侵细菌的重要介质，巨噬细胞释放的NO能抑制细菌的重要生理过程，如结合并破坏关键酶的Fe-S中心，抑制DNA合成、呼吸作用。急性细菌感染中，过多的NO扩散到血管，引发血压急剧下降，带来致命的脓毒性休克。NO也可作为神经递质，控制大量的“植物性”功能，包括肠道括约肌收缩和阴茎的勃起。在脑中，NO可能与记忆的形成有关。学习和记忆的基础长时程增强（Long-termpotentiation，LTP，即重复强烈刺激海马区后，突触效应持续增强）可以被抑制NO合成的药物阻断。NO担当了LTP中突触后神经元反馈信息到前膜的逆行信使的角色。大多数信号分子都是相对较大的“惰性”生物分子，比如蛋白质、氨基酸衍生物、类固醇等，可以和靶点特异性结合。然而，NO却是一个双原子小分子，和“笑气”N2O不同（主要用于牙科麻醉），NO是最小的分子。因为NO带有自由基电子（孤对电子），因此有时以•NO表示一氧化氮。由于孤对电子的存在，其反应活性很高，半衰期只有2~30秒。其可以在溶液中自由扩散，能自由透过生物膜。这使NO成为理想的暂时性旁分泌和自分泌信号分子。此外，能和细胞蛋白的金属中心和其他细胞分子活性基团迅速反应。NO作为信号分子的发现：20世纪70年代晚期，RobertFurchgott试图阐明神经递质乙酰胆碱（Ach）引起的一个矛盾的实验现象:静脉注射Ach后，血压降低，血管舒张；如果在体外直接加到血管,效果图1：NO分子及其生物合成。（a）NO分子的化学结构。N、O键长为0.115nm;（b）NO分子的合成过程。1分子L-Arg经两步氧化，与1分子NADPH+H+和1分子O2生成中间物Nω-羟基-L-精氨酸(NOHLA)，再消耗0.5分子NADPH+H+和1分子O2，生成1分子NO和1分子L-瓜氨酸。每生成1molNO，共需1.5molNADPH+H+和2molO2。该过程需要一氧化氮合酶（NOS,EC1.14.13.39）的催化。abL-瓜氨酸L-Arg《细胞生物学》期中综述-2-相反。Furchgott发现血管的反应依赖于血管最内层细胞——内皮细胞层。如果有内皮细胞层，Ach使血管舒张；但是除去内皮细胞，Ach使血管收缩。Ach似乎引发了内皮细胞释放某种扩散性因子，他命名为“内皮细胞舒张因子”（endothelium-derivedrelaxingfactor，EDRF）。与此同时，FeridMurad研究血管如何在硝基血管扩张剂作用下舒张。硝基血管扩张剂包括硝酸甘油（炸药）、亚硝酸戊酯等，用于治疗心绞痛。他发现这些化合物可能产生NO，增加了血管平滑肌细胞（SMC）内cGMP的含量。很快人们发现EDRF也可升高血管平滑肌cGMP的含量。后来又发现许多物质，如血红蛋白、亚甲基蓝都可抑制EDRF和硝基血管扩张剂的活性，这两项研究在此交汇。1987年，Furchgott和LouisIgnarro发现EDRF和NO是同一种物质。此外，SalvadorMoncada证明NO是由L-精氨酸合成的。然后，又有实验证明不止血管内皮细胞可以产生NO。20世纪80年代后期，免疫学、心血管药理学、神经生物学、毒理学领域的研究人员发现NO是一种重要的生理信号分子，其在血压调控、血液凝固、免疫防御、消化、视觉和味觉、学习和记忆中都有重要作用。也参与许多疾病过程，如糖尿病、中风、高血压、阳痿、脓毒性休克、长期抑郁等。NO这种小无机分子，对公众来说主要是汽车尾气中的污染物，但是在20世纪90年代成为了重要的生物分子，被誉为“明星分子”，并选为1992年度Science杂志年度分子之首[2]。因为对NO在心血管系统中作为信号分子的研究，R.Furchgott，L.Ignarro和F.Murad分享了1998年诺贝尔生理学和医学奖。一氧化氮合酶（NOS）：一氧化氮合酶（NOsynthase）由两个球状蛋白结构域通过弹性蛋白链（flexibleproteinstrand）连接组成[9]。氧化酶结构域有一个催化中心，可以利用L-Arg、氧气和辅因子产生NO；还原酶结构域通过催化NADPH+H+脱氢并将产生的电子在两个结构域的内表面间转移，提供NO合成所需的电子。电子转移的激活是通过小的掌状钙调蛋白（CaM）结合到序列特异性弹性蛋白链实现的。人体存在有3种NOS，即脑细胞NOS（或神经细胞NOS，nNOS）、内皮细胞NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。nNOS和eNOS是组成型的，iNOS可以根据系统的NO需求而开关。增加细胞内Ca2+浓度可以激活nNOS和eNOS；免疫系统激活后，iNOS在许多细胞中产生，对抗细菌感染和其他环境因素，其不受Ca2+调控。对于nNOS和eNOS，钙调蛋白只有在高浓度Ca2+存在的条件下才结合。这样就形成了一个依赖于Ca2+浓度的“分子开关”。这是一氧化氮合酶调控的机制之一[9]。钙调蛋白（Camdulin,CaM,由CAlciumMODULatedproteIN组合而来）可以结合并调控多种蛋白质的活性。CaM是小酸性蛋白，具148个氨基酸残基，分子量~17kD。其具两个对称的结构域，中间由一个弹性蛋白链连接（与NOS类似），其弹性使其可以“包围”靶蛋白，这个性质使CaM可以和许多种靶蛋白结合。蛋白链两边各有2个EF手结构基序，EF手提供电负性环境，每个可以结合1个Ca2+。因此，每个CaM可以结合4个Ca2+。Ca2+结合后，Met的疏水甲基通过构象变化而暴露出来，而使表面疏水，从而可以和靶蛋白的碱性双亲α-螺旋螺旋（BasicAmphiphilicHelices，BAA螺旋）结合，因为BAA螺旋具互补的疏水区域。图2：NOS合酶的结构和钙调蛋白的结构。（a）NOS的不同组分。还原酶结构域（结合了2个FMN分子）通过螺旋形的弹性蛋白链连接到氧化酶结构域（2聚体）的中心。钙调蛋白结合Ca2+后，与中间的连接蛋白结合，激活NOS。目前已经获得了氧化酶的结构，还原酶的结构和P450还原酶类似。但是，目前还没有获得全酶的结构。CaM激活NOS的机制目前也不是特别清楚。目前发现自抑制环和Ｃ端可以形成锁状构象，NADPH结合后关闭，FMN被屏蔽；CaM结合后，锁开放，酶被激活。（引自Ref.9）（b）钙调蛋白。蛋白链两边各有2个EF手结构基序，每个EF手配位结合一个Ca2+。中间由弹性蛋白链连接。（Ref.10）２个FMNab《细胞生物学》期中综述-3-此外，在流体剪切力（fluidshearstress）的作用下，eNOS也可以活化。该途径由Ser/Thr蛋白激酶Akt/PKB介导[6]，这是一种不依赖于Ca2+的调控机制。用渥曼青霉素（wortmannin）抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI(3)K）或将eNOS上的Akt位点突变（Ser1117），将减弱Ser的磷酸化，阻止eNOS的活化。去除胞外Ca2+，仍然可以观察到NO的产生，且不受CaM拮抗剂抑制。剪切力诱导eNOS的活化作为另一种NO产生机制，其产生是通过PI(3)K/Akt/PKB途径实现的。鸟苷酸环化酶（GC）：鸟苷酸环化酶（Guanylatecyclase，GC，编号EC4.6.1.2）是一种裂合酶，催化GTP转变为3',5'-cGMP。GC有两种形式：膜结合（TypeI）和溶解型（TypeII，sGC）。sGC是NO受体，它溶于细胞内基质，与血管舒张相关。sGC是异二聚体蛋白，由α、β亚基组成。鼠β1亚基有620个氨基酸残基，并在真核生物中保守；α1亚基有690个氨基酸残基。α1/β1的sGC对NO反应性高，α2/β2虽然也能对NO做出反应，但活性较弱。sGC的两个亚基有4个结构域：（1）N端血红素结合结构域。该结构域可以结合亚铁血红素，血红素可以结合CO、NO，秀丽隐杆线虫（C.elegans）的血红素还可以结合O2，并以这种方式对低氧作出反应。因此，有人将该结构域成为“血红素-NO和O2结合家族”（H-NOX），以更精确表示其性质。（2）PAS样调控结构域。PAS结构域存在于多种蛋白质，介导蛋白-蛋白相互作用，有时亦可以结合小分子如血红素、黄素、核苷酸等，可以感受多种条件，如光、氧化压力和双原子气体。由于尚未在sGC中精确鉴定出PAS，因此称为PAS样结构域。（3）螺旋结构域。sGC的螺旋结构域与其他蛋白无同源性，目前功能未知。其可能和PAS结构域一起，介导sGC的二聚体化而发挥功能。（4）C端环化酶结构域。每个亚基的有0.5个环化酶结构域，因此两个亚基必须结合，才能发挥功能。该结构域与腺苷酸环化酶（AC）高度同源，催化GTP脱水环化形成3',5'-cGMP。在体外纯化表达该结构域时，如果加β1H-NOX，其活性受到抑制；去掉β1H-NOX-PAS-螺旋结构域后，抑制作用更强；且活性不受NO的影响。这说明β1H-NOX与PAS-螺旋结构域相互作用，调控环化酶的活性；结合NO后，会改变相互作用，削弱抑制作用。NO的作用是通过与H-NOX的亚铁血红素结合实现的。目前尚未获得完整sGC-NO复合物和H-NOX-NO的结构，但得到了O2与H-NOX结合的结构（来自T.tencongensis）[6]。该结构中，Tyr140与O2形成氢键，Trp9和Asn74定位Tyr140。His102与Fe2+形成配位键。这样，在血红素的Fe2+上，形成6配位构象（图3c）。NO具有部分填充的π*轨道，也可与Fe2+形成配位键。亚铁血红素-NO复合物在形成时倾向于以弯曲的几何形式。NO有强trans效应，NO与dz2轨道的轴向离域电子结合，会削弱His-Fe2+间的作用。NO结合末端亚铁血红素后，形成His-Fe-NO复合物（5配位）。图3：（a）GC催化GTP环化生成3',5'-cGMP；（b）血红素中的卟啉环。环上4个吡咯基上的N与Fe2+形成配位键；（Ref.10）（c）sGC中的含铁血红素与氨基酸残基的相互作用。Tyr140与O2形成氢键，Trp9和Asn74定位固定Tyr140，His102与Fe2+形成配位键（引自Ref.5）；（d）sGC的调控机制。sGC随NO浓度的不同，不只是呈现出简单的开关，而是表现出一系列中间活性，并受GTP、A