实验十-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质

实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1.了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2.掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis,PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylsmide简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED加速反应。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白产物。【试剂与器材】（一）试剂（(全班分两大组，每组配一份，如1－5组一份，6－10组一份)（1）30%的凝胶贮备液：ACR30g+Bis0.8g溶于100mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光贮存（1）。（2）3mol/LTris-buffer,pH8.9：Trisbase36.6g+1mol/LHCl48mL+ddH₂O至100mL）（3）0.5mol/LTris-HCl,pH6.8:6.05gTrisbase溶于40mLddH₂O中，加1mol/LHCl48mL,加水补至100mL.（4）5×Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3):（配1L）Tris-base15.1g+甘氨酸94g+5gSDS+H2O至1L（用时稀释5倍）。（5）10%SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。（6）TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20mL(全班共用)，4℃保存。（7）10%AP（过硫酸铵）：10mL，新鲜配制，分装至1.5mL离心管中，－20℃保存待用（2）。（8）样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05mol/LpH8.0Tris-HCL缓冲液。*先配制0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称Tris0.6g，加入50ml重蒸水，再加入约3ml1mol/LHCL,调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml*按下表配制样品溶解液：*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。*或配制2XSDS样品缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH6.8)200mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油必要时加入少量（1%）巯基乙醇。（9）考马斯亮蓝染色液(3)：0.05g考马斯亮蓝R250溶于25mL异丙醇里，加11mL冰醋酸+H2O至110mL，用滤纸过滤除去不溶物。（10）0.1%溴酚蓝指示剂（全班共用）（11）脱色液：75mL冰乙酸+50mL甲醇+875mLH2O（若只配500mL，各物质减半）（二）器材①电泳仪②垂直板电泳槽，电泳板③微量进样器（50μL）④染色/脱色摇床。【操作方法】1.胶板模型的安装：在干净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条（有些型号的电泳板已有固定的隔板），然后将另一块玻璃板压上，用夹子夹紧（或装在制板模型中），在两块板之间滴上热融的10％琼脂糖凝胶封边（4）。2.分离胶的制备[10ml，可供两块板(11cmx10cm)使用]用手轻摇混匀,小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（～2.5cm）,轻轻在顶层加入几毫升去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25℃室温）。3.浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备各种体积的浓缩胶溶液：混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。4.在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100℃）中加热3分钟，马上插入冰上冷却待用。5.浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，小心地拔出梳子，用移液器冲洗梳孔，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。6.按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度而定，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。本实验系统中需要分离鉴定的是纯化的GFP蛋白，点样样品和次序包括：蛋白MarkerpUC18细菌总蛋白pGFP未诱导总蛋白pGFP加Glu及IPTG诱导总蛋白pGFP加IPTG诱导破菌后上清总蛋白层析时的穿流峰（杂蛋白）层析时的洗涤峰I层析时的洗涤峰IIGFP对照7.电泳：开始时电压为5～8V/cm（约100V）凝胶，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压增到10～12V/cm（约180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。8.剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。9.固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2小时。10.脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液3-4次，约4-8小时或过夜。11.将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中。【注意事项与提示】（1)丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。（2）过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的10％过硫酸铵要分装冷藏。（3）考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染色:每分子含有两个SO3H基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。检测灵敏度约为0.2－0.5ug。也可用银染色：将蛋白带上的硝酸银还原成金属银、以使银颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级，但步骤较复杂。（4）制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的麻烦，还可以同时制备多块凝胶。（5）AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。（6）加热使蛋白质充分变性。（7）用移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋白样品的沉降。（8）两玻璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。（9）总量一般不超过20μl，如果点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样品溶解液。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。（10）电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。（11）电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致，不能在凹形板双耳处撬，也不能用死力弄坏玻璃板。（12）考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。（13）脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。【实验安排】本实验试剂配制和电泳可在一天内完成，各小组要在上午配好试剂并做好胶，中午或下午即可开始电泳。【实验报告要求与思考题】1．就实验中出现的各种问题进行分析讨论。2．在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?3．在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用。4．根据下式计算标准蛋白和待测样品的电泳迁移率，然后以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，其分子量的对数为纵坐标作标准曲线图，根据标准曲线图准确计算待测蛋白的分子量。粗略估计待测蛋白分子量的方法是直接根据凝胶上的分子量标准进行估算。5．为什么样品电泳前要高温加热？6．进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？