DNA固相合成

应用固相合成法合成下列碱基顺序的DNA：5'-GCCTAACGTAAC-3'。DNA化学合成时由3'端向5'进行。合成原理步骤如下：一、脱保护基用三氯乙酸脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团DMT（二甲氧基三苯甲基），获得游离的5'-羟基端，以供下一步合成反应。二、活化将质子化的核苷3'-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体（其5'端仍受DMT保护，3'端被活化）。三、连接二步中活化得到的中间体遇到一步中脱保护基的核苷酸，与核苷酸的5'-羟基发生亲核反应，缩合并且脱去四唑，此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基。四、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CPG上的寡糖核苷连接，而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂，得到稳定的寡糖核苷酸。经过上述几个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上，再采取上述同样的步骤，即可得到一DNA片段样品。最后对其进行切割和脱保护基(一般对A、C碱基使用苯甲酰基保护；G碱基采用异丁酰基保护；T碱基则不必保护；亚磷酸用腈乙基保护）。具体则是用苯硫酚除去5'-OH上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去，最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。DNA纯化分离利用HPLC或者PAGE对得到的粗品进行纯化分离，得到所需的DNA分子。DNA序列鉴定检定DNA片段的顺序的方法主要有两种:(1)wanderingSPot方法，主要适用于适用于寡核苷长度在20个碱基以下的片段；（2）化学裂解法，该法核苷酸碱基顺序从凝胶的放射自显影图谱上直接读出，但对于合成产物中少量的不纯物是检测不出来的；具体步骤：各种基团的保护方分别如下图所示：（1）戊糖的保护（2)碱基的保护在本题中保护后的碱基A、C、G分别简记为Ba、Bc、Bg、Bt。因为T无需保护，为书写方便简记为Bt。（3）磷酸酯基的保护：具体合成步骤如下：如此不断重复，最后得到一条DNA分子的长链，其结构如下：得到粗产物后再利用电泳或者HPCL技术加以分离，回收片段最长的。DNA的鉴定经分离纯化后的DNA寡核苷酸片段,应对其质量(包括长度和核苷酸顺序)进行检定。检定DNA片段的顺序的方法:采用wanderingSPot方法，适用于寡核苷酸长度在20个碱基以下的片段。寡核苷酸片段5'一端经[γ一32P]-ATP用T4多核苷酸激酶标记后,经蛇毒磷酸二醋酶进行部分水解,标记混合物于pH=3.5的条件下在醋酸纤维纸上进行电泳,然后在DEAE一纤维素板上进行同系层析,寡核苷酸的顺序通过这一标记消化产物的特定迁移率来测定。此方法的好处在于不仅可测出寡核苷酸的顺序,也可以检出不纯物的污染。参考文献：1.生物化学教材，古练权，高等教育出版社2.DNA的化学合成及其应用，静国忠，生物化学与生物物理进展，1986.43.DNA的化学合成，戚志红、陈常庆，(中国科学院上海生物化学研究所)，专论与综述