膜蛋白抽提工具大比拼

膜蛋白抽提工具大比拼G蛋白偶联受体（GPCR）、整合素、离子通道蛋白……几乎所有的膜蛋白都是研究热点。当然，那是因为它们太重要了。作为细胞结构与功能的关键成分，它们担当了很多重要角色。同时，这些蛋白也是重要的药物靶点。然而，膜蛋白研究的道路上却布满了荆棘。无论是抽提、表达，还是后续的结晶、三维结构分析，都让研究人员伤透脑筋。膜蛋白通过许多疏水氨基酸残基锚定在膜结构里面，很难溶解在水性缓冲液系统中。为了制备膜蛋白样品，传统的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。但去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而又妨碍了膜蛋白的功能研究。根据其明显的疏水性特点，人们常用“去污剂＋机械处理”的操作方法获取膜蛋白，用于增溶的去污剂有离子型（如SDS）和非离子型的（如Triton-X）等。SDS会使多数蛋白完全变性，限制了很多下游分析。非离子型的去污剂较为温和，但抽提膜蛋白（特别是有多个跨膜区的膜蛋白）的效果往往很差。如果有一种有效的膜蛋白抽提方法，既能保持膜蛋白的天然结构（或至少是活性结构），又有较高的产量和纯度等优点，那将成为研究人员的福音。陆陆续续，多个公司都推出了膜蛋白抽提试2剂盒，至于它们的性能如何，有哪些特点，生物通来为你一一解析。Novagen（MERCK）默克Novagen不久前推出的ProteoExtract跨膜蛋白抽提试剂盒（简称为TM-PEK）是一种新颖的膜蛋白制备试剂盒。它是利用基于化学而非去污剂的方法来抽提膜蛋白，而得到的蛋白组分适用于各种常见的蛋白分析，如活性分析、天然和变性的凝胶电泳、WesternBlot、免疫沉淀和质谱等等。TM-PEK的抽提方法也很简单，只有两步。第一步，利用抽提缓冲液1来透化细胞或匀浆的组织，通过离心将可溶（胞质）组分与不可溶（膜）组分分离开。第二步，利用抽提缓冲液2A或2B将膜蛋白从脂双层中抽提出。抽提缓冲液2A与2B的区别在于主角不同，分别为TM-PEK试剂A和TM-PEK试剂B，不过Novagen并没有说明这两者的具体成分。抽提缓冲液2A非常温和，适于脆弱的蛋白复合物。相比之下，2B则更为高效，适用于那些难对付的跨膜蛋白，特别是有多个跨膜区的顽固分子。哪怕是有7个跨膜区的Frizzled-4蛋白也能轻松搞定。你可以通过实验摸索，根据目的蛋白的特点和下游应用来二选一。生物通Tips：如果是第一次使用TM-PEK，当然两个试剂都要试。将同一个样品分成两份，进行平行试验。由于2A较温和，所以产率可能不及2B高，但对于活性分析等应用来说，则是更好的选择。对于大部分跨膜蛋白，TM-PEK试剂A或B的2倍稀释就已足够。但如果抽提效果不理想，你也可以改变一下试剂A或B的浓度，从不稀释到10倍稀释，看看哪个的效果更好。与其他的膜蛋白抽提方法不同，TM-PEK试剂盒不需要超声破碎、剧烈震荡、超速离心或高温孵育，这样，目的蛋白受损的几率就大大降低。每个TM-PEK试剂盒足够处理40个样品，2A20个，2B20个。每个样品约为1-5×107个细胞或25-50mg组织。价格为4300元，每个样品的均价为107.5元。点击索取更详细资料！SigmaSigma-Aldrich在蛋白抽提方面也有相当多的产品，只是宣传不多，很多人都不太了解。它的2009年10月23日第六十七期第3页，共20页下一页返回ProteoPrep®MembraneExtractionKit就专门用于膜蛋白的制备。制备过程如下：细胞重悬于低电导率的缓冲液如Na2CO3中，并通过超声或其他方式破碎细胞。接着用超速离心让膜蛋白沉降，弃上清，洗涤沉淀两次，再用4型蛋白抽提试剂重悬膜蛋白。这个4型蛋白抽提试剂网罗了各种强力的增溶剂如尿素、硫脲、Trizma碱，此外，还增加了一种新型的两性离子去污剂C7BzO，它能增溶多种类型的蛋白，包括膜蛋白。仔细看看这个过程，就知道此试剂盒是专门为双向电泳而设计的，当然也就不考虑膜蛋白的活性了。试剂盒中还包含了还原剂三丁基磷以及烷基化试剂碘乙酰胺，分别还原和烷基化二硫键，能提高等电聚焦（IEF）的分辨率。如果你下游想做活性分析，这个kit显然不适合你。ProteoPrepMembraneExtractionKit足够对付6个样品，1个样品大约为20mg冻干的大肠杆菌，或50-100mg湿细胞，或250mg组织。此试剂盒的价格为2589.21元。另外，对于盒中的4种试剂，Sigma都给出了货号，可以单独购买，这一点非常方便。点击索取更多资料！PIERCE（ThermoFisher）说到蛋白抽提，自然少不了PIERCE。Mem-PER®真核膜蛋白抽提试剂盒就是专门从哺乳动物细胞或组织以及酵母细胞中富集膜蛋白的。试剂盒的成分很清爽，三种试剂-A、B、C。具体是什么试剂，那我可不知道，反正是去污剂。抽提过程也很简单，先用去污剂A来裂解细胞，然后试剂B和C按一定比例混合，来溶解膜蛋白。短暂的离心之后，将这个混合物孵育在37°C，通过相分配将疏水蛋白与亲水蛋白分离。疏水部分即膜蛋白沉在底部，上部则为亲水部分。不过，上部也要保留，千万不要想着弃上清，顺手就扔了，因为可能还会做二次提取。在你得到的产物中，亲水蛋白的比例不超过10%，交叉污染较小。步骤就是这么简单了，大约1小时就能完成。提取效率当然也是因蛋白而异。据PIERCE介绍，能高效提取含1-2个跨膜区的蛋白。他们在三种不同的细胞系（NIH3T3、Hela和C6）中验证过，结论一致。至于Mem-PER试剂盒的下游应用嘛，SDS-PAGE和Westernblot当然没问题。如果要做蛋白活性分析和纯化，那么就要用透析来去除试剂C。如果要做双向电泳的话，还得脱盐、洗涤和富集。此试剂盒大概能用于70次的提取，每次5×106细胞或20mg组织或15mg湿酵母细胞沉淀。价格为2590元，相当于每次37元，还是很亲民的哈。点击索取更多资料！盘点（生物通余亮）名称TM-PEK跨膜蛋白抽提试剂盒ProteoPrep膜蛋白抽提试剂盒Mem-PER真核膜蛋白抽提试剂盒优点两种不同的抽提试剂，适用于不同的膜蛋白和下游应用，使用灵活；高效提取多达7个跨膜区的蛋白专门为双向电泳而设计，还包含还原剂和烷基化试剂步骤简单，价格亲民，能高效提取含1-2个跨膜区的蛋白缺点价格偏贵需要超速离心；下游不能用于活性分析要经过一定的处理才能进行活性分析或双向电泳处理量40个样品，每个样品约为1-5×107个细胞或25-50mg组织6个样品，每个样品约为20mg冻干的大肠杆菌，或50-100mg湿细胞，或250mg组织70个样品，每个样品为5×106细胞或20mg组织或15mg湿酵母细胞沉淀价格4300元2589.21元2590元厂家Novagen(MERCK)Sigma-AldrichPIERCE(ThermoFisher)页，共20页下一页返回