HER2免疫组化检测的质量控制

HER2免疫组化检测的质量控制苏州大学附属第一医院郭凌川1内容提要•HER2检测的质量控制和质量保证–HER2检测质量的影响因素•检测前•检测中•检测后–HER2检测的质量保证•内部质保•外部质保•Ring研究HER2检测的质量控制和质量保证3质量体系－定义•质量控制（QC）–用以确保HER2检测结果正确性的内部验证步骤•质量保证（QA）–通过与其他实验室检测结果相比较而得到的检测技术评价的方式（例如，外部控制）BilousM,etal.ModPath2003;16:173–182.质量控制与质量保证有何区别？质控•达到和/或维持目标质量•在检测中每个步骤均进行样品检查，从而决定是否进行相关改进•操作步骤的内部验证•每批实验都应进行•确保每个检测结果均准确质保•旨在改善总体检测操作•与其他检测中心相比较质控/质保原则（推荐）内部质量控制a)染色•严格遵守免疫组化或原位杂交操作步骤•设立对照组:–细胞系和组织标本免疫组化评分0/1+,2+,3+需经原位杂交确定•若对照组检测未能达标，需重新进行实验b)评分•评价:–若正常组织检测为阴性而肿瘤组织检测细胞膜膜染色阳性，则免疫组化检测即以足够–乳腺癌：仅浸润性肿瘤–不均匀:选择代表性区域–异质性特异区域:按最高分评分c)实验室•设立适当对照组d)检测步骤•难以确定的检测病例1)重新检测2)将免疫组化检测结果与原位杂交检测结果对比3)咨询外部实验室e)记录•使用标准化检测报告表•记录任何:–与标准化标本处理步骤相违背的不当操作–难以确定病理诊断的病例持续质量评价a)对相关从业人员进行教育培训b)每年重新检测约5%的阳性和阴性病例c)参与Ring研究AdaptedbypermissionfromMacmillanPublishersLtd;BilousMetal.ModPathol2003;16:173─182.©2003.质控/质保原则（推荐）内部质量控制a)染色•严格遵守免疫组化或原位杂交操作步骤•设立对照组:–细胞系和组织标本免疫组化评分0/1+,2+,3+，2+需经原位杂交确定•若对照组检测未能达标，需重新进行实验b)评分•评价:–若正常组织检测为阴性而肿瘤组织检测细胞膜膜染色阳性，则免疫组化检测即以足够–胃癌或胃食管交界癌：选择代表性区域–不均匀:选择代表性区域–异质性特异区域:按最高分评分c)实验室•设立适当对照组d)检测步骤•难以确定的检测病例1)重新检测2)将免疫组化检测结果与原位杂交检测结果对比3)咨询外部实验室e)记录•使用标准化检测报告表•记录任何:–与标准化标本处理步骤相违背的不当操作–难以确定病理诊断的病例持续质量评价a)对相关从业人员进行教育培训b)每年重新检测约5%的阳性和阴性病例c)参与Ring研究AdaptedbypermissionfromMacmillanPublishersLtd;BilousMetal.ModPathol2003;16:173─182.©2003.HER2检测质量的影响因素8影响IHC检测结果之常见问题•诸多因素会影响IHC结果的评估标本固定较差1染色不均细胞质染色,IHC02弥散性非均一性细胞质染色标本点状假阳性染色2棕色点状染色为胞质染色而非胞膜染色标本边缘假阳性染色1肿瘤标本边缘染色而中心无染色1.WHanna供图;2.Dako供图.影响FISH检测结果之常见问题标本制备染色步骤固定不完全1片状染色;信号较弱或缺失过分固定1持续性自发性荧光;信号较弱或缺失消化封闭不完全2较强自发性荧光；背景亦呈现较强非特异性染色1.Abbott供图;2.Ventana供图.取样组织处理固定方式检测仪器精准度实验室步骤固定时间检测方法验证检测人员抗原修复类型实验试剂对照实验条件使用图像分析判读标准报告内容评分系统HER2检测偏倚检测后检测前检测中影响HER2检测结果之因素WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118─145.HER2检测的影响因素：检测前12影响HER2检测结果之因素:检测前取样组织处理固定方式固定时间Pre-analyticHER2检测偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.检测前取样–原发性乳腺癌•最好为手术切除而非活检标本，包含癌旁乳腺组织•避免细针穿刺活检取样–转移性乳腺癌•穿刺活检取样–胃癌•经内镜活检取样或经手术切除之标本影响HER2检测结果之因素:检测前取样HER2检测偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.检测前HER2检测偏倚影响HER2检测结果之因素:检测前组织处理方式•提供新鲜及已定位之标本或切除后迅速经甲醛固定之标本–立即转送至备检实验室:•尽量缩短从标本切除至浸入10%NBF固定之间的时间，通常控制在20–30分钟以内–乳腺癌：最多1小时–胃癌：20–30分钟之内•从手术切除到实验室接收之间的组织处理不当会造成不理想和不一致的HER2检测结果–最坏的情况下，检测有可能失败组织处理HER2检测偏倚检测前HER2检测偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145;《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》编写组乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂志2009,38(12):836–840.《胃癌HER2检测指南》编写组胃癌HER2检测指南中华病理学杂志2011;40(8):553-557.影响HER2检测结果之因素:检测前固定时间–乳腺癌•最少6小时•不超过48小时–胃癌•穿刺活检最少1小时（以便充分固定）•比较大的样本需要至少8小时•不超过48小时固定时间HER2检测偏倚检测前HER2检测偏倚《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》编写组乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂2009;38(12):836–840.《胃癌HER2检测指南》编写组胃癌HER2检测指南中华病理学杂志2011;40(8):553-557.影响HER2检测结果之因素:检测前固定方式–首选10%中性缓冲福尔马林（NBF）–10%NBF相当于4%甲醛溶液固定方式HER2检测偏倚检测前HER2检测偏倚WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测的影响因素：检测中18影响HER2检测结果之因素：检测中检测仪器精准度实验室检测步骤检测人员抗原修复类型实验试剂对照实验条件HER2检测偏倚检测中WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.检测方法验证影响HER2检测结果之因素：检测中验证检测方法•用于检测之实验步骤应经已知实验结果验证•标准化实验条件需经标准化试验方法验证后才可常规应用HER2检测偏倚检测中检测方法验证WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.影响HER2检测结果之因素：检测中检测仪器之精准度•应有常规校准及维护检测仪器的相关操作流程–移液器–孵育箱–水浴锅–温度计检测仪器精准性WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测偏倚检测中仪器准确度指该实验仪器能正确显示操作者的设定方式－正确运作仪器精确度指该实验仪器每次操作都能显示相同的检测结果－可重复性影响HER2检测结果之因素：检测中实验室步骤•须经验证之免疫组化实验步骤实验室步骤HER2检测偏倚检测中WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.影响HER2检测结果之因素：检测中检测人员•相关检测人员应接受正规检测技术培训（包括资格考试）并给予相应支持•定期考评：例如年度考评检测人员WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145;《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》编写组乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂志2009,38(12):836-840HER2检测偏倚检测中影响HER2检测结果之因素：检测中抗原修复类型•所采用之抗原修复系统与现有实验条件相适应，并能产生可重复性结果抗原修复类型WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测偏倚检测中相同FISH阴性乳腺癌组织标本应用相同浓度抗HER2抗体检测结果合理抗原修复过度抗原修复假阳性抗原修复对免疫组化检测结果很重要图片由AMorey,StVincent’sHospital,NSW,Australia提供.影响HER2检测结果之因素：检测中检测试剂•所有试剂应确保其质量稳定，经对照组实验验证后可使用•所有验证应当记录，签名和登记日期检测试剂WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测偏倚检测中影响HER2检测结果之因素：检测中对照•对照组与实验组实验过程应一致•应使用已知实验结果的组织作为对照•可用已经验证的对照检测新抗体活性•用于对照的组织标本可自行制备或购买而得对照HER2检测偏倚检测中阳性及阴性对照组织标本阳性对照组理想之阳性对照组,HER2阳性(IHC3+)11.WHanna供图;2.LBornstein供图.MDA-MB-175,HER2阴性(IHC1+)2对照细胞系之准备SK-BR-3,HER2阳性(IHC3+)1内部对照设置•患者标本中肿瘤未累及部分可作为内部阴性对照组；若阴性对照结果亦出现染色，则原肿瘤标本之染色结果无效•对照监控–如若对照组未显示预期结果，则实验应重做例如，正常乳腺上皮膜染色重复免疫组化检测WHanna供图.影响HER2检测结果之因素：检测中检测实验条件•检测应于适当条件下进行•温度及湿度的变化会影响染色结果•检测条件需确保得到可靠且可重复的HER2检测结果检测条件WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.HER2检测偏倚检测中如何达到高质量免疫组化检测•勿让低年资实验室技术人员配置试剂–若试剂未能正确配制，免疫组化结果将不可靠–低年资技术人员应接收试剂配制训练及上级指导监督•正确的抗体稀释可避免免疫组化的误差–记录每次抗体稀释的浓度，每次登记相应日期及时间–如遇错误检测结果，上述记录数据可用来追溯错误原因•完善改进抗原修复方法–较耗时但必须进行设计验证步骤•目的–确定经证实或验证之相关实验步骤是否可于本实验室可行•确定检测参数–固定–检测方法及条件–试剂及浓度–操作设定(若自动化操作)–操作人员技术能力•样本(检测组)–选择25–100个样本用不同经证实的检测方式进行检测，可使用组织芯片•请注意:乳腺癌与胃癌标本进行检测验证应分开进行设计验证步骤•记录实验验证的每一操作步骤–这些记录可用于建立实验室标准化操作参考指南•记录所有操作步骤•若任何一个步骤发生变化，整个实验必须重做•目标：阳性及阴性实验验证组与原实验结果达95%的一致性使用自动化平台有助HER2检测标准化方法抗体单位HER2检测准确性自我评估专家评估自动4B5694.7%95.2%自动A0485390.0%92.0%自动CB11481.0%83.5%手动A0485678.4%85.7%手动CB11981.6%82.0%手动SP3278.0%88.0%如果使用自动化检测，必须基于现有的经验证的手动操作方案PQCC委员会提供数据•国家质量控制认证项目中自动与手动HER2检测方法对比HER2检测的影响因素：检测后35影响HER2检测结果之因素：检测后图像分析方法判读标准报告内容评分系统HER2检测偏倚检测后WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.影响HER2检测结果之因素：检测后检测结果判读标准及评分系统•需依国内/国际HER2检测指南进行标准化操作HER2检测偏倚检测后HER2检测偏倚判读标准评分系统图像分析方法IHC检测结果判读及评分•多数操作指南推荐下列分析免疫组化检测结果的标准：–依细胞染色百分比及强度进行评分:•乳