16SrDNA在细菌鉴定中的应用

细菌16SrDNA技术在细菌鉴定中的应用主讲人：李新琼一、细菌基因组的提取细菌基因组提取的主要方案包括：1、水煮模板；2、CTAB/NaCl法；3、盐析法多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称PCR技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝，PCR技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。二、16SrDNA的PCR扩增1、PCR实验原理PCR技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板DNA，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension）。变性（denaturation）：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。退火（annealling）：将下降至适宜温度（一般较Tm低5℃），引物与变性的DNA单链（模板）在碱基互补的基础上形成引物-模板杂交双链。由于反应体系中引物浓度远远大于模板DNA浓度，且引物结构简单，这极大地限制了变性后模板DNA单链之间的互补结合。延伸（extension）：将温度上升至在70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的从5’向3’端DNA链延伸反应，随着4种dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)的掺入，合成新的DNA互补链。PCR（PolymeraseChainReaction)的原理2、16SrDNA的核酸序列16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。较之5S和23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区（variableregion）和与之相同的11个恒定区（constantregion），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。注：V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9为可变区位置。F27、R534，F357、R926，F968、R1492为三对扩增引物。核苷酸序列及其位置是以大肠埃希菌为参考序列。•DNA模板•引物•耐热聚合酶反应缓冲液•dNTP•含Mg2＋3、PCR反应体系１、DNA模板：反应中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA纯度较高，以增加反应特异性。２、dNTP:反应体系中达100μM～200μM。３、Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。４、引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。５、Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性DNA聚合酶，在95℃时30分钟还有50％活力。4、PCR体系中各组分的作用及含量PCR法的操作过程Step1:DNA热变性Step2:引物退火Step3:引物延伸例如：艾伯特埃希菌16SrDNA扩增引物为通用引物:27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31429R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3三、琼脂糖凝胶电泳四、DNA测序及比对1、用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并送至测序公司进行序列测定。2、将测序得到的16SDNA的序列在NCBI进行blast比对，选择与比对序列高度相似的菌株。3、将选择的序列与测序的序列用MEGA软件构建菌株进化树。4.用于发现细菌新种类5.TheMicroSeq50016SrDNA细菌鉴定系统3.用于鉴定血液培养的细菌2.用于区分进化关系密切的细菌1.用于鉴定难以培养的细菌五、基于16SrDNA的应用六、16SrDNA的不足1、有的菌种由于种间差异小，单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充。2、16SrDNA鉴定是基于PCR的鉴定方法，与其它PCR鉴定方法一样存在容易污染，获得假阳性结果，应注意做好阴性对照。谢谢！