纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸实验目的1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。实验原理层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。分配层析分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配情况不同而使之得到分离的方法。分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同。分配系数(K)的定义是：K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)二、纸层析(一)原理纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：Rf=X/Y式中X：溶质斑点中心的移动距离Y：溶剂前沿移动的距离Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。(二)影响Rf值的主要因素1.物质的结构和极性物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。2.滤纸不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值。3.层析所用的溶剂同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等4.pH值溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值。5.温度温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积.所以温度的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。6.展开方式同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf值不相同。用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较小。7.样品溶液中杂质样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。(三)操作方法1.样品处理用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。2.点样将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用微量注射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量为5-30μg。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。3.平衡点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成,严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。4.展开平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。(1)上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长。(2)下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。(3)环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特制滤纸。（4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。5.显色为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。(1)显色剂显示：被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法、浸渍法或涂刷法。(2)紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。6.定性分析层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。7.定量分析对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有：(1)剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。(2)直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。(3)面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。实验材料与试剂实验试剂1、氨基酸标准液(1mg/mL)五种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分别配制成一定浓度的溶液。2、展开剂是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2(正丁醇：水：乙酸=4：1：1)3、0.2%茚三酮丙酮溶液。4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)。实验器材:1、滤纸。2、培养皿(直径115mm)。3、电热鼓风干燥箱。4、喷雾器及吹风机。5、点样管及点样架。6、针、线、尺。7、烧杯(50mL)。实验操作（一）、标准氨基酸纸上层析1、单向上行层析(1)、氨基酸Rf值的测定A、滤纸：选用国产滤纸，10cm×20cm，在距纸边2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔2cm处画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.3cm。B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含5～20μg为宜，用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.3cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用一加热装置(如吹风机)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，特别是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。C、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置，晾干，使纸上溶剂自然挥发，直至除净溶剂。酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮5ml。温度25℃，时间1h。注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。展层溶剂每张约需25mL。D、显色：待展层基本结束后,，置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。计算出5种氨基酸在酸系统中的Rf值。大家需要带的物品1、直尺2、针线（白线）3、实验报告纸（完成实验报告）4、电吹风5、口罩注意使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。