pcr与引物设计-简

KLP生物信息学PCR技术与引物设计目录PCR的概念与创建PCR的原理与特点PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用引物设计的基本原则特异引物的设计简并引物的设计一、PCR的概念与创建多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶是一种模拟天然DNA复制的体外扩增DNA序列的技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。72℃延伸94℃变性55℃退火PCR循环PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想；1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现；1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术；1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年；1993年度，Mullis荣获诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要二、PCR的原理与特点PCR技术的原理•加热使双链DNA解开螺旋•↓•在退火温度条件下引物同模板DNA杂交•↓•在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物•↓•重复上述变性→退火→引物延伸过程至25-40个循环。靶序列被扩增上百万倍，•达到体外扩增核酸序列的目的。体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物5’3’加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。三、PCR的反应体系和条件PCR反应五要素•引物（primer）•酶（TaqDNApolymerase）•dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•模板（template）•Mg2+（magnesium）标准的PCR反应体系•10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物各200μmol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100μl1）PCR反应成分PCR反应条件（1）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物使用中的注意事项：•1）、引物的溶解：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或灭菌双蒸水，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。待引物溶解后应分装-20℃保存，反复冻融会影响扩增效率。•2）要根据引物的用途不同选择不同的纯度级别：引物纯化的方式有C18柱脱盐纯化，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。•3）引物的保存：没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。（2）酶及其浓度•目前有两种TaqDNA聚合酶供应–天然酶：从栖热水生杆菌中提纯–基因工程酶：大肠杆菌合成•一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）•浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少（3）dNTP的质量与浓度•dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系–dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活–dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0-7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解–在PCR反应中，dNTP应为50-200mol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量–dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低（4）模板（靶基因，targetgene）•模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一•传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本–SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；–蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。模板（靶基因，targetgene）•提取的核酸即可作为模板用于PCR反应•一般检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增•RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA（5）Mg2+浓度•Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响•在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mmol/L为宜•Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。退火(复性)温度与时间•退火温度是影响PCR特异性的较重要因素•变性后温度快速冷却至40℃-60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞•退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度•对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：•Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）•复性温度=Tm值-（1-5℃）–在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性•复性时间一般为30-60sec，足以使引物与模板之间完全结合（3）延伸温度与时间：•延伸温度：一般选择在70-75℃之间–常用温度为72℃–过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。•延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定–1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）–3-4kb的靶序列需3-4min–扩增10Kb需延伸至15min•延伸进间过长会导致非特异性扩增•对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些（4）循环次数•循环次数–决定PCR扩增程度•循环次数–主要取决于模板DNA的浓度•循环次数：选在25-40次之间•循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多经典循环参数（1000bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃5min常温forever四、PCR的类型和应用1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究PCR的类型高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物12341234DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失4）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4标记引物ＰＣＲ观察PCR产物5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两侧的序列对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定化PCR）VHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLcDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作7）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列原位PCR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达8）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增基因mRNA蛋白质多肽链9)荧光定量PCR（real-timePCR)•通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪•荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和