生物物理学林东海第五章生物物理技术6等温微量量热法

内容一．ITC方法的基本原理二．ITC方法的主要优点三．ITC方法的主要应用一.ITC方法的基本原理生物分子相互作用过程的定量描述蛋白质P与配体L相互作用（1:1结合）：当体系达到平衡时，结合平衡常数Ka：Ka倒数为解离平衡常数Kd：DissociateconstantKd定量描述蛋白质与配体的相互作用强度（affinity）mM---弱作用，μM---中等强度作用，nM---强作用分子结合反应是吸热或放热过程复杂反应过程：整个反应过程能够自发进行的条件是△G0.当△H0时，说明反应由焓驱动；当–T△S0时，说明反应由熵驱动；即△S0,整个反应是个熵增的过程。量热法（Calorimetry）在程序控温过程中，测量热量随时间的变化关系差示扫描量热法(DSC)等温微量量热法(ITC)DSC(DifferentialScanningCalorimetry)通过检测生物体系在控温过程中的热量变化，获取与蛋白质热变性有关的大量信息研究：生物分子的热稳定性，蛋白质构象变化、热稳定性、热变性的原因,热变性动力学,热稳定性与生理活性的关系，等等。根据测量方法的不同,分为：功率补偿差示扫描量热法热流式差示扫描量热法。ITC通过监测配体滴定到蛋白质溶液过程中的热量变化，对结合反应过程进行热力学分析，直接测量多个热力学常数，定量表征生物分子间相互作用。ITC是目前研究生物分子相互作用的最有力工具之一，常用来测量结合强度，确定结合部位个数。ITC(IsothermalTitrationCalorimetry)ITC仪结构原理示意图ITC仪包括两个相同的小池，由高效导热物质(镍合金)制成，外面包围着隔热套。灵敏的热电堆/热电偶电路可检测两小池以及小池与隔热套之间的温差。靶蛋白溶液放在样品池中，小分子由计算机控制的步进电动机通过注射器精确地滴加到样品池中，同时搅拌样品池中液体，使反应物迅速混合。在滴加滴定剂前，一个稳定的电功率加到对照池上，通过反馈电路激活样品池上的加热器，代表了基线的信号。实验中直接观察的是为了保持样品池和对照池温度相等随时间变化所要求的电功率输入。在滴加过程中，热量变化取决于结合反应是吸热反应还是放热反应。反馈电路对样品池增加或减少电功率，保持两池温度相等。对单个结合部位的结合，滴定小分子引起的热量变化：V0是样品池的体积，△Hb是蛋白质结合配体引起的焓变化，[M]t是蛋白质总浓度，[L]是自由配体浓度在量热滴定过程中，反应涉及的热量与结合的小分于是成比例的滴定开始时，大部分加入的小分子都与靶标分子结合，导致了大的吸热或放热信号；随着配体浓度的增加，蛋白分子逐渐被饱和，随后再滴加滴定剂，则少量的热量被吸收或放出。对多个独立结合部位的结合，滴定小分子引起的热量变化总量：ITC典型滴定曲线一次ITC实验就可以同时测定Ka，N,△Haa定义无量纲的C值：C=Ka[M]N要精确测定结合常数，C：1-1000，C值太大限制了Ka的测定，因为滴定曲线太陡，在接近平衡时，收集的数据太少；C值太小，则得不到典型的S型曲线，曲线太宽，接近线性，不能得到等值点。1.相同的蛋白质浓度，结合力Ka--》减少2.相同的Ka，蛋白质浓度Mtot---》升高ITC实验设计不同C值的ITC滴定曲线例子-1：μM结合的实验数据4-carboxybenzenesulfonamidemolarratio对磺酰胺基苯甲酸例子-2：mM结合的实验数据甲砜胺二.ITC方法的优点对研究体系的溶剂、光谱和电学等性质没有限制。方法灵敏度和精确度高MicroCal型号：最小可检测热功率2nW，最小可检测热效应125nJ，生物样品最小用量0.4μg，响应时间小于10s。可获得生物分子相互作用完整的热力学数据：结合常数Ka,结合位点数n,结合焓△H，恒压热容△Cp，动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）。实验时间较短(典型ITC实验只需30-60分钟)精确度高，操作简便计算机控制实验过程，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，由计算机完成整个实验，并用Origin软件分析ITC数据。测量时不需要制成透明清澈的溶液,无损检测量热实验后样品可以进行后续生化分析。ITC系统的性能MicroCalITC产品三.ITC方法的应用蛋白质-蛋白质相互作用：抗原-抗体相互作用，分子伴侣-底物相互作用，等等。蛋白质-小分子相互作用，酶-抑制剂相互作用蛋白质-核酸相互作用核酸-核酸相互作用核酸-小分子相互作用生物分子-细胞相互作用DNA/RNA-药物相互作用酶促反应动力学蛋白质折叠/去折叠RNA折叠1.研究Ras，Cdc42与底物（effector）的结合ThermodynamicsofRas/EffectorandCdc42/EffectorInteractionsProbedbyIsothermalTitrationCalorimetryHerrmannC.,J.Biol.Chem.276:23914-23921(2001).Ras是一种在信号传导过程中起重要作用的蛋白质，可以向其下游的许多信号传导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态与GDP结合，当GDP被GTP取代时被激活，与底物（Raf，RalGDS,3-磷脂酰肌醇激酶）发生紧密的结合。Cdc42是一种GTPase,也是信号传导相关的蛋白，它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。CdC42在参与细胞骨架调控的过程中，重要的一步是与WASP蛋白的相互作用。6μM50μM6μM50μMStructureandcharacterizationofanovalchickenbiotin-bindingproteinA(BBP-A).HytonenV.P.,etal.BMCStructuralBiology,7:8(2007).BBP—A是一种类抗生素蛋白（AVD）,具有β折叠的结构，对BTN具有高亲和力，但具有不同于其他抗生素蛋白家族成员的热稳定性和免疫学特性。BBP—A拥有特异的结合BTN和BSO的配体结合特性，目前作为生物工艺学新材料得到应用。2.检测BBP—A和AVD与BTN和BSO结合能力的差异ITCanalysisofbBBP-AandAVDforBindingBTNandBSO:(a)AVD-BTN,(b)AVD–BSO,(c)AVD-D-biotinsulfone,(d)bBBP-A–BTN,(e)bBBP-A–BSO(f)bBBP-A–D-biotinsulfone3.其它一些应用例子蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质-配体相互作用WrightandSerpersu,Biochemistry,44:11581-11591(2005).妥布霉素是一种对革兰氏阴性菌、多种革兰氏阳性菌有作用的氨基糖苷类抗生素氨基糖苷核苷转移酶妥布霉素蛋白质-配体相互作用CooperA,etal.,FEBSLett.348:41-45(1994).SAM---腺苷甲硫氨酸LiJ.andWeisR.M.(1996)蛋白质-受体相互作用三链DNA的形成Kamiyaetal.,JACS118:4532-4538（1996）.