生物物理实验技术与方法复习资料

生物物理实验技术与方法一、紫外光谱1、红外、紫外和可见光谱的划分红外吸收光谱属于分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m；紫外吸收光谱属于电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可见吸收光谱属于电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm。2、能级跃迁与光谱（1）转动能级间的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；（2）振动能级的能量差ΔEv约为：0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；（3）电子能级的能量差ΔEe较大1～20eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区，紫外—可见光谱或分子的电子光谱（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。（5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能相同，但εmax不一定相同；（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。3、红移与蓝移λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，4、吸光度A与透光度T的关系:A＝－lgT朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。5、摩尔吸光系数ε（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）可作为定性鉴定的参数；（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。ε105：超高灵敏；ε=(6～10）×104：高灵敏；ε2×104：不灵敏。（6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。6、偏离朗伯—比耳定律的原因引起这种偏离的因素（两大类）：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；难以获得真正的纯单色光。朗—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯—比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。A总=A1+lg2-lg(1＋10－εbc)=0；即：1=2=则：A总＝lg（Ｉo/Ｉt）＝bc≠0若0；即21；－bc0,lg(1＋10bc)值随c值增大而增大，则标准曲线偏离直线向c轴弯曲，即负偏离；反之，则向A轴弯曲，即正偏离。｜｜很小时，即ε1≈ε2：可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若浓度较高，即使｜｜很小，A总≠Ａ1，且随着c值增大，A总与A1的差异愈大，在图上则表现为A—c曲线上部(高浓度区)弯曲愈严重。故朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。（2）化学性因素。朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。当溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。7、紫外—可见分光光度计基本组成（1）光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。（2）单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。（3）样品室样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。（4）检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。（5）结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理8、分光光度计的类型（1）单光束简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。（2）双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。（3）双波长将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。ΔA＝Aλ2－Aλ1＝(ελ2－ελ1)bc两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合以两组分x和y的双波长法测定为例：设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为:ΔAx和ΔAy，则该体系的总吸光度差ΔAx+y为：ΔAx+y=ΔAx+ΔAy如何选择波长λ1、λ2有一定的要求。①选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。②在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。9、测定条件的选择（1）选择适当的入射波长一般应该选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。（2）选择合适的参比溶液（为什么需要使用参比溶液？）测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。参比溶液的选择一般遵循以下原则：①若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；②若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；③若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；④若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。（3）控制适宜的吸光度（读数范围）不同的透光度读数，产生的误差大小不同：－lgT=εbc微分：－dlgT＝－0.434dlnT=-0.434T-1dT=εbdc两式相除得：dc/c=（0.434/TlgT）dT以有限值表示可得：Δc/c=（0.434/TlgT）ΔT浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透光度误差ΔT有关，而且与其透光度读数T的值也有关。是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？最佳读数范围与最佳值设：ΔT=1%，则可绘出溶液浓度相对误差Δc/c与其透光度T的关系曲线。当：ΔT=1%，T在20%～65%之间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T%=20～65%(吸光度A=0.70～0.20)。可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为：Tmin＝36.8%,Amin＝0.43410、示差分光光度法（示差法）普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cscx)。则：Ax=εbcxAs=εbcsΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx－cs）=εbΔc测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。ΔA＝Ax－As=εb(cx－cs）=εbΔc测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔA。示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx：cx=cs+Δc示差法标尺扩展原理普通法：cs的T=10%；cx的T=5%示差法：cs做参比，调T=100%则：cx的T=50%；标尺扩展10倍11、紫紫紫外外外---可可可见见见光光光谱谱谱在生物系统中的应用（1）氨基酸、蛋白质的吸收特性大部分氨基酸在230．310nm范围内没有吸收，只有芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫的氨基酸在此范围内有吸收.对于蛋白质来说，在波长大于250nm的范围内，所测得的吸收主要来自芳香氨基酸；在210～250nm范围内，主要的吸收除了来自芳香氨基酸外，还来自组氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸。胱氨酸、半胱氨酸中的二硫键基团在230～270nm范围内有吸收，在185～230nm的范围内还有很强的吸收，而蛋白质和多肽除了表现出氨基酸的吸收特性外，蛋白质和多肽中的肽键在180～230nm范围内也有强吸收。在波长小于210nm的范围内，吸收主要来自多肽主链，由肽键产生的190nm左右的吸收强度大约相当于芳香氨基酸在280nm的吸收强度的100倍。（2）核酸的吸收特性核酸中的生色团是碱基，组成核酸骨架的核糖和磷酸的跃迁需要的能量更高。核酸的吸收谱与其中的各种碱基之间的相互作用有很大关系。核糖核酸和脱氧核糖核酸被相应的酶水解后，吸光度都会增加。利用这一现象，可以测定DNA和RNA混合物中DNA和RNA的含量。（3）过渡金属复合物的紫外一可见吸收谱过渡金属复合物的紫外一可见吸收谱可以用d—d跃迁来解释，吸收峰位和峰强度不仅取决于过渡金属本身，还与金属的配基及空间配位的情况有关。（4）用紫外—可见吸收光谱测量蛋白质和核酸等生物大分子的浓度紫外—可见吸收光谱是蛋白质和核酸定量分析的一种很方便的方法，在生化研究中已经成为最常规的工具。蛋白质的浓度测量通常是测量样品在280nm处的吸光度(A280)，如果280nm处的摩尔消光系数ε280已知，就可以由A=εCI得到蛋白质的浓度。蛋白质的A280主要是由于色氨酸和酪氨酸侧链的吸收，因此知道了ε的大小，也就知道了单位长度的蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基的数目。常规制备的蛋白质中常常含有核酸，利用紫外吸收光谱可以测量核酸／蛋白质复合物中蛋白质和核酸的量。蛋白质和核酸在280nm和260nm处都有吸收峰。但是蛋白质在280nm处吸收更强，而核酸在260nm处的吸收更强。由此存在关系式：蛋白质浓度(mg／mL)=1.55A280-0.76A260A280和A260分别是溶液在280nm和260nm处的吸收度。如果蛋白质中混有20％的核酸，或是浑浊样品，这种方法的测量误差是比较大的。许多其他的生物分子，如不同的维生素分子，也往往有它们的特征紫外—可见吸收光谱，利用与蛋白质、核酸浓度测量类似的原理，也可以测量其他生物分子的浓度。（5）用紫外—可见吸收光谱研究生色团的环境由于生色团所处的环境可