单细胞RT-PCR技术及应用研究进展

-1-单细胞RT-PCR技术及应用研究进展吴梦瑞，朱蕾，梁燕浙江大学生命科学学院，浙江杭州（310058）E-mail：[e-mail]摘要：出现于90年代初期的单细胞RT-PCR技术开启了单细胞基因表达研究的大门。近十年来，单细胞RT-PCR技术不断发展：从检测到克隆，从定性到定量，从单个cDNA的合成到整个cDNA文库的构建。与此同时，这项技术的应用也逐渐拓展到信号转导，细胞分化，胚胎发育和抗体免疫等多个方面。这项技术有望进一步发展完善并应用于生产。关键词：单细胞，RT-PCR，技术，应用单细胞RT－PCR技术始创于1991年，Yeh与Elerwine[1]将其与膜片钳（Patchclamp）技术结合，用以神经生物学的研究。在神经离子通道的研究方面，与膜片钳相结合的单细胞RT-PCR技术成功地揭示了电生理学和分子生物学之间的联系。随着时间的发展，单细胞RT-PCR技术不断完善，不仅在神经生物学的研究上应用越来越广泛，而且逐渐突破膜片钳技术的限制，向胚胎发育和免疫学等领域的进一步发展。近年来，新的单细胞RT-PCR体系不断建立，从初期的基因检测，到现在的定量检测、基因克隆和文库构建，精确度和灵敏度都大大提高。该技术能够精确地研究特定的单细胞的基因表达，从而大大推动神经生物学、胚胎发育和免疫学等的发展。但由于对技术的高度要求以及对外界干扰的高度敏感，单细胞RT-PCR的应用受到了一定的限制。因此这项技术在体系上有待于进一步的完善，在应用上有待于进一步的扩展。1.单细胞RT-PCR的技术的现状多细胞生物是高度分化的系统，即使一个组织也可能是由不同的细胞组成，而个体的分化、发育、生长和癌变都和全基因组的差异表达相关。多细胞RT-PCR所需的模板量相当于105—107个细胞的mRNA(通常是ng级)。如果用它来研究这些调控和表达的差异性，就必然要求大量的同质性细胞。然而，特定的研究情况下细胞材料可能来源很少，比如体液中的免疫细胞，胚胎发育初期的全能/多能性性细胞以及异质性组织中的某些细胞。单细胞RT-PCR技术的发明，解决了模板来源少和多细胞RT-PCR之间的矛盾，实现了模板量从ng级到pg级的飞跃（一个细胞所能提供的总mRNA量约为105个）。模板量少是这项技术的优点，同时也是这项技术的难点。实验中要考虑很多问题：如何有效地获得和裂解单个细胞，如何减少RNA的降解、如何避免杂片断的污染，如何提高逆转录和PCR的效率。传统的RT-PCR技术使用各种方法提纯总RNA或mRNA，检测RNA量，再进行RT-PCR。单细胞的RT-PCR为了尽量减少mRNA的损失，裂解、RT、PCR经常是在一个反应管里进行（0.2ml[2,3]的EP管），PCR结束后再检测产物的浓度。RNA酶是单细胞RT-PCR的克星，单细胞操作实验最好有专用的实验室和试验设备，对于预处理（灭菌和DEPC水处理各种设备）的要求相对较高，试验者要勤换手套，RNA酶抑制剂（Rnaseinhibitor）更是必不可少；考虑到外源RNA的污染，试验过程中还需要设置对照组（不含对象细胞），只有对照组是阴性而实验组是阳性才说明克隆出了目的基因[18,19]。1.1单细胞的获得单细胞RT-PCR第一步是获得单个完整的细胞(膜片钳技术是获得RNA)。这一步的关键-2-在于快速精确地操作，尽量减少在操作中由于外界刺激和时间过长引起的细胞表达上的改变，以及外源RNA和RNA酶的污染。目前比较常用的方法包括膜片钳技术（patchclamp）[3,4]、激光显微切割技术（lasermicrodissection）[5-7]，显微吸管操作[2]以及流式细胞仪（FACS）[8]。膜片钳技术是在单细胞RT-PCR中最早使用也是最成熟的一项技术，且广泛用于神经生物学上。膜片钳的原理是在毛细管和细胞膜间形成高阻封接后，向毛细管内施加负压，吸破细胞膜，继续用负压吸出细胞质放在EP管中。这项技术的缺点在于无法研究不具备被负电吸附特点的mRNA[3,4],而且mRNA黏附在膜片钳管壁内部会造成损失。在非神经细胞的研究当中，主要用到的是后面的三种方法。激光显微切割技术和显微吸管操作都则用到倒置显微镜：如果细胞在异源性组织中且无法用显微镜直接辨别，就必须先用免疫标记的方法对细胞标记；如果细胞处在同源性组织中或者是体外培养，就可以直接进行操作。而对于流式细胞仪来说，细胞必须先进行免疫标记。激光显微切割技术的原理是首先将细胞制成切片[6,7]（为了能使mRNA得到最大限度的保存，整个操作最好在25分钟内完成[6]），不加盖玻片。然后在倒置显微镜下用鼠标选中要切除的细胞，点击切除按纽后，激光由切片下方发出，高密度的激光束，将细胞弹射到切片上边。打开的Eppendorf管固定于切片上边，就可以直接收集细胞。细胞也可以直接收集到cap中[6,7,9]。单个细胞的切除可以在数秒钟内完成，数十个细胞的完整切除可以在数分钟内完成[7]。但其在操作过程中很容易带入比所需细胞小的细胞，临近细胞mRNA污染比较严重[5,6]。近期的研究为我们提供了一种避免污染的方法：用粘性的无菌纸在cap表面轻压，粘去这些小细胞[6]。显微吸管操作所需器材十分简易，但对操作要求较高，吸管的动力各异，甚至用嘴操作（mouth-controlledhand-drawnPasteurpipette）[10]。在倒置显微镜下，通过液压传动装置和特定管径的吸管（一般来说是细胞管径的1/3[11]）将细胞转移到含有裂解液的Eppendorf管中[11]。由于这种方法快速准确，应用相对较广。FACS的原理是对细胞进行荧光标记，在一恒定的速度和剂量逐滴流出高度稀释的细胞悬液，如果检测到有荧光，即可对液滴进行收集[8]，收集在96孔PCR板（96－wellPCRplate）[8,12]中。流式细胞仪的主要优点在于污染较少，通过荧光标记的方法可以准确无误地获得所需的细胞。但是由于流式细胞仪获得细胞首先要对细胞表面进行荧光标记，所以只有对于那些表面有特定特征的细胞才比较方便（比如具有表面抗原的B细胞,事实上这也是分离单个B细胞进行RT-PCR时使用较普遍的方法），而且增加了工作量和细胞处理的时间。另外，流式细胞仪所获得的细胞很难保证就是单个。2003年，GregoryP.O.[12]等用FACS分离单个B细胞时，通过将荧光头（fluorescentbead）一并接收到well里，观察每个well里bead少于一个来确定确实只有一个细胞。1.2单细胞的裂解在上述的所有方法当中，除了膜片钳是可以直接获得细胞质以外，其他方法所获得的细胞都是完整的，要进行进一步的实验，必须先将细胞裂解。与多细胞裂解的方法相比，单细胞有所不同。单细胞裂解多采用化学裂解的办法，裂解液中含有RNAse抑制剂以及一定浓度的蛋白变性剂（如1%，0.5%[13-15],0.4%[14]的NP40，2.5%的Triton[16]等），常温裂解[13]或者冰冻解冻的循环裂解[15]。多细胞裂解之后，要进行一步分离提纯才进行RT-PCR；对于模板微量-3-的单细胞实验来说，提纯的做法显然是不可行的，那么裂解液的成分是否会对后期的RT-PCR造成影响呢？2005年，KathryneM.K.[6]等以单个CD38+细胞为材料，检测了不同的裂解方法对单细胞RT-PCR的影响，实验证明比起提存的损失，裂解液的成分的影响可能是微不足道的。实验分六组，前五组裂解后离心至新的EP管中，后一组裂解后直接在原管中进行RT-PCR。前五组的裂解条件是：含1%NP40的裂解液在冰上冰冻解冻三次循环；1%NP4080℃；3%NP4042℃；3%NP4042℃；1%NP4042℃；3%NP4080℃；最后一组的裂解条件是1%NP4042℃。反应时间都是20分钟。RT-PCR的结果表明，最后一组的效率是最高的（4/6），其次是第一管（1%NP4080℃，1/6）。最终实验者通过在原管1%的NP40进行三次冰冻解冻的裂解试验细胞，并证明这种方法是最高效的。同时，实验者在相同的条件下对三个细胞和单个细胞进行比较实验，发现结果相似。除了化学方法外，也可以通过物理方法使单细胞破裂。2002年武汉大学的几位实验者[2]以拟南芥的胚胎细胞为材料，在倒置显微镜下，用微吸管吸取细胞，将细胞压紧反应器皿（Petridish）的底部，研磨使细胞破裂并释放出大量的RNA。1.3单细胞mRNA逆转录为cDNA以及微量cDNA的进一步扩增总的来说，单细胞RT－PCR与多细胞RT－PCR没有太大差别，但是需要对反应的条件作一定的优化，尤其是注意酶的使用和循环次数的选择。在RT的过程中，通常选用没有RNase活性的、高效率的逆转录酶，比如Superscriptase9,18,H-Reversetranscriptase2等；单细胞RT的反应体系较小，但通常在5ul-20u内[1-19]，且5-15ul居多。但是引物的浓度和dNTP的浓度一般不会比多细胞的RT体系(引物200U，dNTP0.5mM)多。如果按照单位浓度dNTP/引物:单位浓度模板来看，单细胞RT体系还是比多细胞RT体系要大很多。使用大比例的引物有利于增大模板和底物结合的几率。如果将逆转录理解为一个可逆反应的过程，较大比例的dNTP有利于反应向cDNA合成的方向进行。成功进行逆转录后，合成的cDNA的拷贝数仍然是较少的。在PCR阶段，与多细胞相似，酶离子浓度、退火温度和时间控制等都和模板及引物自身有关；多少RT产物将用于进一步的PCR过程是不一定的，主要和想要克隆的基因的丰度相关。其次，可以优化PCR的条件也可以提高PCR的效率：（1）槽式PCR和半槽式PCR[20-22]，它们的原理都是进行两轮PCR，第一轮使用普通引物进行扩增，第二轮以第一轮扩增出的DNA为模板，以槽式引物进行扩增。所谓槽式引物，是引物是和模板两端若干个碱基以内的序列配对。半槽式区别于槽式，主要是前者第二轮扩增的时候一端为普通引物，一端用槽式引物，后者都用槽式引物，槽式PCR和半槽式PCR可以大大提高扩增的效率和特异性，但是与此同时也大大加大了引物设计的难度。（2）对于在细胞中拷贝不算太低的基因，可以增加PCR的循环次数，一般到45-50个循环[4,5,8,17,18]。之后就到达平台期，扩增的DNA量无法显著地提高了。（3）每次循环后适当地增加延伸的时间[13]和退火的温度[22]，也有助于特异性和扩增效率的提高。2．单细胞RT-PCR技术的发展及应用从应用的领域上来分，单细胞RT-PCR技术目前应用于神经生物学，胚胎和细胞发育和免疫学三个方面。而从技术本身来看，单细胞RT-PCR逐渐发展，已经从简单的检测基因表达，扩展到定量测mRNA含量、单细胞文库构建、特异性蛋白克隆多个方面。-4-2.1定量和半定量的单细胞RT-PCR技术定量的单细胞RT-PCR技术原理是，在体外合成所要研究的mRNA，制成浓度梯度溶液，在相同条件下进行RT-PCR并检测cDNA含量，绘制成曲线；以相同的条件扩增和测定目的细胞中该mRNA的cDNA，对照标准曲线，估测出细胞内该mRNA的表达情况。[5,24,25]这项技术可以定量地监测出单个细胞里特定基因的表达强度，从而更精确地研究细胞中某些蛋白的表达状况，细胞的分化程度和细胞间的细微差别。原来的单细胞RT-PCR技术只要求从单细胞中扩增出基因，然而对于定量实验，要同时顾及实验的精度（和真实值的区别）和灵敏度（即最低可以测量的浓度）。为了保证精度，对无RNase和时间的要求更加苛刻[25]，因为mRNA不稳定和Rnase的影响，时间延长mRNA分解增加会使得定量不准确；其次，在细胞的获取和裂解上，一般用微吸管和化学裂解的方法，因为如果用膜片钳技术很难保证RNA全部被吸出，而用显微切割技术则很容易引入外缘RNA（正如文章前面所述）；为了保证灵敏度，实验尽量选用小体系的PCR，如20ul。[24]首先，定量和半定量的单细胞RT-PCR技术的一个应用是分析单个细胞动力学基因表达。Aki