第09章 化学发光免疫分析技术

第九章化学发光免疫技术一、化学发光的概念二、应用于标记技术的化学发光剂三、化学发光免疫技术的类型本章主要内容分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁至激发态，再返回基态的过程中，释放光子，称为发光。什么是发光？根据能量来源不同：①光照发光：短波照射②生物发光：酶→ATP能③化学发光：氧化还原基态分子激发态分子吸收能量光能热能电能化学能释放能量其他形式光辐射荧光磷光化学发光（chemiluminescence）：伴随化学反应过程所产生的光辐射现象。X射线一、化学发光的概念一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ直接化学发光若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ间接化学发光酶促发光：经酶催化反应生成发光的底物，产生光辐射。化学发光剂：在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。二、应用于标记技术的化学发光剂成为化学发光剂的条件：①物理、化学特性与被标记物匹配，不能相互影响；②能与被标记物形成稳定的偶联体；③在使用浓度范围内对生物体无毒性。（一）直接化学发光剂吖啶酯三联吡啶钌（二）酶促反应发光剂鲁米诺及其衍生物AMPPD二、应用于标记技术的化学发光剂〔3-(2ˊ-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〞磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕吖啶酯：在碱性条件下被H2O2氧化时,生成N-甲基吖啶酮，并发出波长为470nm的光。（一）直接化学发光剂不需酶催化，可直接标记，并参与发光反应三联吡啶钌（电化学发光剂）（一）直接化学发光剂[RU(bpy)3]2+氧化失电子TPA(三丙胺)阳极++++[RU(bpy)3]3+TPA+.(阳离子自由基)TPA.(自由基)不稳定激发态[RU(bpy)3]2+.基态（二）酶促反应发光剂利用酶标记，使底物催化并发光常用酶和底物：HRP→鲁米诺及其衍生物AP→AMPPD1.鲁米诺（1）自发荧光鲁米诺（PH8.6）+H2O2→发光（强度弱，时间短）（2）催化发光鲁米诺+H2O2+HRP→发光（强度高，时间长，稳定）2.AMPPD金刚烷——二氧四节环——苯环——磷酸基团AP形成不稳定的中间体断裂光子三、化学发光免疫技术的类型（一）直接化学发光免疫分析（二）化学发光酶免疫分析（三）电化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。（一）直接化学发光免疫分析（一）直接化学发光免疫分析发光磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体冲洗后（1）加入H2O2（pH10）（2）加入碱（pH10）（一）直接化学发光免疫分析磁微粒模式图Y特点–抗原和抗体结合与未结合部分的易分离磁微粒技术分离结合的标记抗体（二）化学发光酶免疫分析是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(AP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光电检测系统检测光强度，经数据处理后计算出测定物的浓度。辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图（二）化学发光酶免疫分析（三）电化学发光免疫分析磁微粒包被抗体；加抗原和三联吡啶钌标记抗体；加TPA；电极磁铁吸引分离；通电；电化学发光。小结２.以双抗体夹心法为例，说明化学发光酶免疫分析的原理。１.列举２种常用化学发光剂。