发酵工程原理与技术应用

发酵复习资料1,发酵工程原理与技术应用：2,发酵工业的特点：1．一步生产：微生物发酵是由一系列极其复杂的生化反应组成，反应所需的各种酶均包含在微生物细胞内。2.反应条件温和3.原料纯度要求低：常以农副产品作原料，如薯干、麸皮等。原料来源丰富，价格低廉。4.设备的通用性高:对微生物发酵来说，无论好氧发酵还是厌氧发酵，它们的发酵设备都大同小异，即好氧的一般都用搅拌式发酵罐加空气过滤系统。厌氧发酵都用密封式发酵罐。5.对环境的污染相对较小：发酵所用的原料是农副产品，废水中虽然生物需氧量（BOD）、化学需氧量（COD）较高，但有毒物质少。6.生产受自然条件限制小3，工业发酵的类型：按微生物对氧的需求可分为需氧发酵、厌氧发酵以及兼性厌氧发酵。按培养基物理性状可分为液体发酵和固体发酵。按工艺流程分为分批发酵、连续发酵（又分为单级恒化器连续发酵、多级恒化器连续发酵及带有细胞再循环的单级恒化器连续发酵））和补料发酵。4，发酵生产的工艺流程：○1用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制；○2培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌○3扩大培养有活性的适量纯种，以一定比例将菌种接入发酵罐中；○4控制量适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；○5将产物提取并精制，以得到合格的产品；○6回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。5，发酵工业菌种品种：细菌枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等放线菌链霉菌属、小单胞菌属酵母啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等霉菌根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉及青霉等未培养微生物6，发酵工业对菌种的要求：1，能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物2，有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作要强3，遗传性能要相对稳定4，不易感染它种微生物或噬菌体5，产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）6，生长快，发酵周期短，生产特性要符合工艺要求7，培养条件易于控制7，微生物菌种的分离筛选的步骤：定方案——采样：有针对性地采集样品——样品预处理富集培养——菌种分离——菌种的初筛和复筛——菌种发酵性能鉴定——菌种保存8，次级代谢：最初定义为由微生物合成，但对其自身的生长、繁殖和发育并没有影响的一类物质的过程。,初级代谢：通常把微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质称为初级代谢产物，而产生这些物质的代谢体系或过程称为初级代谢。分为：分解代谢和合成代谢。9，诱变育种中需考虑的若干因素：选择合适的出发菌株；复合诱变剂的使用（扩大基因突变的频率）；诱变剂剂量的选择（对不同微生物使用诱变剂的剂量是不同的）；变异菌株的筛选10，诱变育种的基本步骤：出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选11，退化机理及其防止措施：菌种退化主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。主要原因：基因突变、连续传代。采用减少传代、经常纯化、创造良好的培养条件、用单细胞移植传代以及科学保藏等措施，不但可以使菌种保持优良的生产能力，而且还能使已退化的菌种得到恢复提高。12，设计适宜于工业大规模发酵的培养基应遵守的原则：○1必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。○2有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率。○3有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。○4有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。○5尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化，并尽可能减少“三废”物质.○6原料价格低廉，质量稳定，取材容易。○7所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。13，碳源作用及常见种类：1、作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所必须的碳成分。2、来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃、低碳醇。（特殊情况下，如碳源缺乏时，水解物或氨基酸等也可被微生物视为碳源使用）14，氮源：主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。15，生长调节物质包括生长因子、前体、产物抑制剂和促进剂16，培养基类型：培养基按其组成物质的纯度可分为合成培养基和天然培养基；按其状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种。17，碳氮比对菌体代谢调节的重要性（作业，正交实验）：培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的影响极为显著。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，PH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多则容易形成较低的Ph;若碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶。微生物在不同生长阶段对碳氮比的最适要求也不一样。一般，因为碳源既作为碳骨架参与菌体和的合成又作为生命过程中的能源，所以比例要求比氮源高。18，不同发酵时期染菌对发酵的影响即如何让处理（1）种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液营养丰富，培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施：降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。19，杂菌污染的途径、防治：（1）种子带菌防治：1，培养基及器皿彻底灭菌2，制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制3，沙土制备时要多次间歇灭菌4，注意接种时的无菌操作5，子瓶，母瓶的移种和培养6，无菌室和摇床间都要保持清洁，无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，活用化学药品灭菌。（2）设备的渗漏或“死角”1，设备渗漏染菌主要指发酵设备，管道，阀门等长期使用过程中，由于化学腐蚀，电化学腐蚀，腐蚀，加工制作不良等原因造成微小漏孔后发生渗漏而染菌。预防：先用优质材料，定期检查（水式试漏法，集气桶试漏，涂煤油）2，设备“死角”是指由于操作，设备结构或人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能到达预订的灭菌部位或该部位的冷空气不易在加热过程中排净，从而不能达到彻底灭菌要求的部位。a，发酵罐的死角预防：加强清洗并定期铲除污垢。在发酵罐设计制造时在一些死角部位专门设计一路小径蒸汽管道通达此处进行专门灭菌处理。b，管道安装不当或配置不合理形成的“死角”预防：采用单独的排气，排水，排污管。法兰的加工，焊接和安装要符合灭菌要求，垫片内径与法兰内径要匹配，安装时对准中心，同时尽可能减少连接法兰。（3）空气带菌预防：a，正确选择采气口，高空采气或装前置粗过滤器。b，根据气候条件，设计合理空气预处理流程，尽可能减少过滤空气的含油量和湿度。c，设计和安装合理的空气过滤器，防止其失效，选用除菌效率高的过滤介质。(4)培养基灭菌不彻底1，原料性状的影响固形物含量多的原料，升温过快或混合不均匀时容易结块，块中菌不易被消灭。预防：采用实罐灭菌为好，在升温前先搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化。如有大颗粒，可先过筛除去，再进行灭菌。2，灭菌时温度与压力不对由于操作不合理，未将罐内的冷空气完全排除，造成压力表显示“假压”，蒸汽压力不足，达不到要求温度。预防：实罐灭菌升温时，打开所有液面下的进气阀和液面上的排气阀及有关连接管的边阀、压力表的接管边阀等，使蒸汽通过，从而彻底灭菌。3，灭菌过程中产生大量泡沫严重时泡沫可上升顶甚至逃逸，杂菌很容易藏在泡沫中。预防：加入少量消泡剂。4，培养基成分油脂，糖类及一定浓度的蛋白质增加了微生物的耐热性，高浓度有机物会在细胞周围形成一层薄膜，从而影响热的传入。预防：灭菌温度应高些。5，培养基phph越低，微生物耐热能力越差。预防：ph在6.0---8.0时，适当延长灭菌时间。6，培养基物理状态固体培养基传热系数比液体小的多且无对流作用。预防：固体培养基灭菌时间长。7，培养基中微生物数量天然培养基含菌量多应适当延长灭菌时间。含芽孢杆菌多的培养基应适当升温和延长时间。（5）操作不当预防：操作一定要严格规范，防治操作失误引起染菌。（6）噬菌体染菌噬菌体感染能力非常强，传播蔓延迅速，发酵体系易受其污染。防治：以净化坏境为中心的综合防治法。20，无菌技术包括：干热灭菌法原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物；湿热灭菌法原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性；射线灭菌法原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡；化学药剂灭菌法原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活；过滤除菌法原理：利用微生物不能透过滤膜除菌；火灭菌法原理：利用火焰直接杀死微生物。20，（作业）为何产用高温短时灭菌k=Ae(–△E/RT)')''ln()ln(1212EEkkkk△E＞△E’﹥)''ln(12kk12kk﹥12''kk由于灭菌时杀死微生物的活化能△E大于培养基成分破坏的活化能△E’，因此随着温度的上升，微生物比死亡速率常数增大倍数要大于培养基成分破坏分解速率常数的增加倍数。也就是说，当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基成分破坏的速率。根据这一理论，培养基灭菌一般选择高温快速灭菌法，换言之，为达到相同的灭菌效果，提高无菌温度可以明显缩短灭菌时间，并减少培养基因受热时间长而遭到破坏的损失。21，温热灭菌的对数残留定律dN/dt=-kNN：菌体个数（个）t:灭菌时间（min）k：反应速度常数（min-1）dN/dt:菌受热死亡速率(个/min)22，种子培养：是指将冷冻干燥管，沙土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程，这种纯培养物称为种子。种龄：种龄是指种子的培养时间。接种龄是指种子罐中培养的菌丝体转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间23，分批发酵：是一种准封闭培养的例子，是指一次性投料、接种直到发酵结束，此过程中发酵液始终留在发酵罐内。因此分批发酵的过程属于典型的非稳态过程。连续发酵：在分批发酵时向发酵罐以适当的速率添加新鲜培养基和放出等量的发酵液，则可以获得一个相对稳定的连续发酵状态，即在发酵罐中形成的新细胞数量与从发酵罐中流出的细胞数量相等。24，影响微生物耗氧的因素1，微生物本身遗传特征的影响2，培养基的成分和浓度3，菌龄4，发酵条件5，代谢类型25，泡沫的危害：主要表现在：1降低了发酵罐的装料系数。发酵罐的装料系数一般取0.7通常充满余下空间的泡沫约占所需培养基的10%，且其余成分也不完全与主题培养基相同。2增加了菌群的非均一性。由于泡沫高低的变化和处在不同生长周期的微生物随泡沫漂浮或粘附在罐壁上，使这部分的菌体有时在气相环境中生长，引起菌的分化甚至自溶，从而影响了菌群的均一性。3增加了污染杂菌的机会。发酵液溅到轴封等处，容易染菌。4大量起泡，控制不及时回导致“逃液”，导致产物流失。5消泡剂的加入有时会影响发酵产量或给下游分离纯化与精致工序带来麻烦。26，放罐时间对下游的影响放罐时间过早，会残留过多的养分如糖，脂肪，可溶性蛋白等，增加提取工艺