GST-TAT-P53c融合蛋白的表达及对p53基因突变型肿

书书书ＧＳＴＴＡＴＰ５３ｃ融合蛋白的表达及对ｐ５３基因突变型肿瘤细胞的促凋亡作用吴少平１，２，王玉霞１，武军华１，贾培媛１，王晨宇１，李　前１，孙曼霁１（１．军事医学科学院毒物药物研究所，北京　１００８５０；２．北京市疾病预防控制中心，北京　１０００１３）摘要：目的　研究Ｐ５３蛋白Ｃ端（Ｐ５３ｃ）对ｐ５３基因突变型肿瘤细胞ＳＷ４８０的促凋亡作用。方法　用人类免疫缺陷病毒ＴＡＴ蛋白的蛋白转导域（ＴＡＴ）将Ｐ５３ｃ运载进入肿瘤细胞，用氧依赖性降解区域（ＯＤＤ）控制Ｐ５３ｃ在组织中的稳定性。通过ＰＣＲ方法制备ＴＡＴＯＤＤｐ５３ｃ（ＴＯＰｃ），ＴＡＴｐ５３ｃ（ＴＰｃ）及ｐ５３ｃ基因，与ｐＧＥＸ４Ｔ载体连接后在大肠杆菌中表达谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）ＴＡＴＯＤＤＰ５３ｃ（ＧＳＴＴＯＰｃ），ＧＳＴＴＡＴＰ５３ｃ（ＧＳＴＴＰｃ）及ＧＳＴＰ５３ｃ等融合蛋白。免疫组化方法检测ＴＡＴ蛋白运载融合蛋白穿过ＳＷ４８０细胞膜的作用，ＭＴＴ法检测融合蛋白对ＳＷ４８０细胞活力的影响，流式细胞仪检测致ＳＷ４８０细胞凋亡作用。结果　成功构建ｐＧＥＸ系列表达载体，并在大肠杆菌中可溶性表达。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，重组蛋白可以和ＧＳＴ单克隆抗体特异性结合。免疫组化显示ＧＳＴＴＰｃ，ＧＳＴＴＯＰｃｍ及ＧＳＴＴＯＰｃ均能进入ＳＷ４８０细胞，ＧＳＴＴＰｃ能明显降低ＳＷ４８０细胞活性，导致ＳＷ４８０细胞凋亡。含ＯＤＤ的融合蛋白在常氧环境中对肿瘤细胞有轻度促凋亡作用。结论　ＴＡＴ可以介导其融合蛋白跨越细胞膜。ＧＳＴＴＰｃ可引起ｐ５３突变型肿瘤细胞凋亡。关键词：蛋白质Ｐ５３；蛋白转导域；氧依赖性降解域；细胞凋亡中图分类号：Ｑ７８，Ｒ９７９．１文献标识码：Ａ文章编号：１０００３００２（２００７）０１００２８０６　　　收稿日期：２００６０３２０　接受日期：２００６０４１７　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３５０７２２０７）　　作者简介：吴少平（１９７１－），男，湖北省洪湖人，主管医师，博士；孙曼霁（１９３１－），男，河南省安阳市人，中国科学院院士，主要从事生化药理学研究。　　联系作者　Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　Ｔｅｌ：[phone]　　对肿瘤相关基因的研究证实，有近５０％的实体瘤存在ｐ５３基因突变，并且对常规治疗产生抵抗作用［１－２］。突变的Ｐ５３蛋白丧失野生型Ｐ５３的功能，同时抑制Ｆａｓ诱导的凋亡途径［３］。研究表明，将Ｐ５３蛋白第３６１～３８２位氨基酸残基（Ｐ５３ｃ）注射入肿瘤细胞，能激活Ｐ５３潜在的ＤＮＡ结合功能［４］，激活Ｆａｓ介导凋亡途径，从而恢复野生型Ｐ５３蛋白功能［５］。人类免疫缺陷病毒ＴＡＴ蛋白的第４７～５７位氨基酸残基为蛋白转导域（ＴＡＴ），可运载各种大分子、生物活性治疗药物进入细胞甚至通过血脑屏障，ＴＡＴ可转导进入细胞的物质包括肽类、蛋白质、ＤＮＡ、脂质体、ｌａｍｂｄａ噬菌体和铁粒等［６］。氧依赖性降解区域（ｏｘｙｇｅｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，ＯＤＤ）是控制缺氧诱导因子１α（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α，ＨＩＦ１α）稳定性的关键区域，其核心区域为ＨＩＦ１α的５６７～５７４位氨基酸。在常氧条件下，氧分子激活泛素蛋白酶途径，最终使ＯＤＤ及其下游序列被蛋白酶降解，导致半衰期小于５ｍｉｎ；在缺氧条件下，ＨＩＦ１α蛋白可稳定存在［７］。本研究构建质粒表达ＴＡＴＯＤＤＰ５３ｃ（ＴＯＰｃ）融合蛋白，通过ＴＡＴ介导Ｐ５３ｃ进入肿瘤细胞，ＯＤＤ使Ｐ５３ｃ在缺氧肿瘤细胞中稳定存在，在常氧正常细胞中快速降解，减少Ｐ５３引起的不良反应。由于ＴＯＰｃ蛋白分子质量为６．４ｋｕ，因此选用ｐＧＥＸ表达载体融合表达，研究其抗肿瘤作用。１　材料与方法１．１　试剂ｐＧＥＸ４Ｔ１质粒，Ａｍｅｒｓｈａｍ公司；结肠癌细胞株ＳＷ４８０，协和医科大学基础医学院细胞中心；细胞培养液（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓｍｅｄｉｕｍ，ＩＭＤＭ），二甲亚砜（ＤＭＳＯ），ＭＴＴ，四甲基联苯胺（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）及硫酸萄聚糖，Ｓｉｇｍａ公司；９６孔细胞培养板，６孔细胞培养板，Ｃｏｓｔａｒ公司；小鼠·８２·中国药理学与毒理学杂志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ　　２００７年２月；２００７　　Ｆｅｂ；　２１（１）：２８－３３２１（１）：２８－３３抗日本血吸虫谷胱甘肽Ｓ转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）单克隆抗体，Ｚｙｍｅｄ公司；辣根过氧化物酶（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）标记兔抗小鼠ＩｇＧ及生物素链霉抗生物素蛋白免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ凋亡检测试剂盒，北京宝赛生物技术有限公司。１．２　ｐＧＥＸ系列载体的构建为了确证Ｐ５３ｃ对肿瘤细胞的作用，将Ｐ５３ｃ氨基酸序列的第１０～１３位氨基酸由“ＬｙｓＳｅｒＬｙｓＬｙｓ”突变为“ＡｌａＳｅｒＡｌａＡｌａ”，构建了Ｐ５３ｃ突变体（Ｐ５３ｃｍ）；设计ＴＡＴＰ５３ｃ（ＴＰｃ）对照以确证ＯＤＤ的功能，而设计单独Ｐ５３ｃ对照用来验证ＴＡＴ效果。故本研究共设计了４个载体，分别为ｐＧＥＸＴＯＰｃ，ｐＧＥＸＴＯＰｃｍ，ｐＧＥＸＴＰｃ及ｐＧＥＸｐ５３ｃ。所有基因片段均通过ＰＣＲ方法完成。系列引物由北京赛百胜公司合成：Ｐ１：５′ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＴＡＧＡＣＧＴＧＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＧ３′；Ｐ２：５′ＣＴＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＡＡＡＧＣＡＣＧ３′；Ｐ３：５′ＧＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＡＡＧ３′；Ｐ４：５′ＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧ３′；Ｐ５：５′ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣ３′；Ｐ６：５′ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣ３′；Ｐ７：５′ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧ３′；Ｐ８：５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＧＧＴＣＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣ３′。分别将片段Ｐ１与Ｐ２，Ｐ３与Ｐ４等量混合，加入ＰＣＲ反应体系，用ｐｆｕＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ３０个循环。经２％凝胶电泳回收ＰＣＲ片段，再以回收片段等量混合后作为模板，以Ｐ１和Ｐ４为引物进行ＰＣＲ。回收ＰＣＲ片段，将回收片段经ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切后与同样双酶切的ｐＧＥＸ４Ｔ１质粒片段按３∶１比例混合，加入Ｔ４连接酶体系，４℃连接过夜，转化大肠杆菌ＤＨ５α。经ＰＣＲ及测序鉴定证明克隆成功，命名为ｐＧＥＸＴＯＰｃ。以ｐＧＥＸＴＯＰｃ质粒为模板，以Ｐ１和Ｐ５为引物，进行ＰＣＲ后回收片段，经ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切后与ｐＧＥＸ４Ｔ１质粒片段连接，构建ｐＧＥＸＴＯＰｃｍ质粒。以ｐＧＥＸＴＯＰｃ为模板，以Ｐ６和Ｐ７为引物，进行ＰＣＲ后回收片段，经ＢａｍＨⅠ与ＳａｌⅠ双酶切后与ｐＧＥＸ４Ｔ１质粒片段连接，构建ｐＧＥＸｐ５３ｃ质粒。以ｐＧＥＸｐ５３ｃ为模板，以Ｐ８和Ｐ７为引物，进行ＰＣＲ后回收片段，经ＥｃｏＲⅠ与ＳａｌⅠ双酶切后与ｐＧＥＸ４Ｔ１质粒片段连接，构建ｐＧＥＸＴＰｃ质粒。所有质粒均经ＰＣＲ及北京奥科生物公司测序鉴定。１．３　ＧＳＴ系列融合蛋白的表达与纯化将ｐＧＥＸ系列重组质粒分别转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞。挑选单菌落接种于含氨苄青霉素的ＬＢ培养液中，３７℃培养到Ａ６００ｎｍ＝０．６左右时，加入异丙基βＤ硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβＤｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）至终浓度０．６ｍｍｏｌ·Ｌ－１，继续培养４ｈ。收集菌体，经ＰＢＳ洗涤２次后，用ＰＢＳ重悬，超声破菌。离心取上清液，经ＧＳＴ亲和层析柱纯化，分别收集ＧＳＴＴＯＰｃ、ＧＳＴＴＯＰｃｍ、ＧＳＴＴＰｃ及ＧＳＴＰ５３ｃ融合蛋白，经１２％ＳＤＳＰＡＧＥ电泳鉴定。１．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法验证表达的融合蛋白将纯化的ＧＳＴＴＯＰｃ、ＧＳＴＴＯＰｃｍ、ＧＳＴＴＰｃ及ＧＳＴＰ５３ｃ融合蛋白按常规方法进行ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，然后将蛋白转到硝酸纤维素膜上，加入５％脱脂奶粉置３７℃封闭３０ｍｉｎ，再加入小鼠抗血吸虫ＧＳＴ单克隆抗体（１∶２０００），４℃过夜。洗涤３次后，加入兔抗鼠ＨＲＰＩｇＧ（１∶１０００），置３７℃反应３０ｍｉｎ。经硫酸萄聚糖处理后用四甲基联苯胺显色５ｍｉｎ，终止反应。１．５　免疫组化法检测融合蛋白的越膜作用结肠癌细胞株ＳＷ４８０常规培养于含有１０％胎牛血清、５０ｋＵ·Ｌ－１青霉素和５０ｇ·Ｌ－１链霉素的ＩＭＤＭ培养液中，在３７℃，５％ＣＯ２培养箱中培养。将细胞制成单细胞悬液，计数，调细胞数到１×１０８Ｌ－１。在６孔细胞培养板中制作贴片，待细胞长到５０％满时，加入用培养液配制的ＧＳＴＴＯＰｃ，ＧＳＴＴＯＰｃｍ，ＧＳＴＴＰｃ及ＧＳＴＰ５３ｃ，使终浓度为１０．０μｍｏｌ·Ｌ－１，继续培养３０ｍｉｎ。用冷ＰＢＳ洗涤细胞，再将细胞贴片用无水乙醇固定１５ｍｉｎ。与３％过氧化氢孵育５ｍｉｎ，以消除内源性过氧化物酶的活性。用１０％正常山羊血清封闭３０ｍｉｎ，加入１∶２０００稀释的小鼠抗血吸虫ＧＳＴ单克隆抗体，置４℃过夜，加生物素标记二抗，３７℃孵育３０ｍｉｎ，加辣根过氧化物酶标链霉抗生物素蛋白，３７℃孵育３０ｍｉｎ后，用ＤＡＢ显色５ｍｉｎ，终止反应，干燥后阅片。１．６　ＭＴＴ法检测ＳＷ４８０细胞活力取对数生长期的ＳＷ４８０细胞制成单细胞悬液，计数，将细胞悬液调到１×１０８Ｌ－１，接种于９６孔培养板中，每孔１００μＬ。分别加入用培养液配制的ＧＳＴＴＯＰｃ，ＧＳＴＴＯＰｃｍ，ＧＳＴＴＰｃ及ＧＳＴＰ５３ｃ，使终·９２·中国药理学与毒理学杂志　　２００７年２月；２１（１）浓度为０．０１，０．１，１．０，１０．０及２０．０μｍｏｌ·Ｌ－１。另设对照孔加１００μＬ培养液。每种处理均设３个复孔。培养６８ｈ后，各孔加入５ｇ·Ｌ－１ＭＴＴ１０μＬ，继续培养４ｈ，吸去上清液，再向每孔加入ＤＭＳＯ２００μＬ。将９６孔培养板震!５ｍｉｎ，用酶标仪测定吸光度（Ａ５７０ｎｍ）值。实验重复２次。１．７　流式细胞仪分析ＳＷ４８０细胞凋亡将ＳＷ４８０细胞接种于３０ｍＬ培养瓶中，待细胞长至５０％时加入ＧＳＴＴＯＰｃ，ＧＳＴＴＯＰｃｍ，ＧＳＴＴＰｃ及ＧＳＴＰ５３ｃ，使终浓度为２０．０μｍｏｌ·Ｌ－１，继续培养１６ｈ。将细胞制成单细胞悬液，调密度至１×１０９Ｌ－１，按ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ凋亡检测试剂盒说明书处理细胞，ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ和ＰＩ染色，４℃反应３０ｍｉｎ，１ｈ内经流式细胞仪检测细胞凋亡。１．８　实验数据用珋ｘ±ｓ表示，用ＳＰＳＳ软件单因素方差分析和Ｄｕｎｎｅｔｔｔ比较。２　结果２．１　ｐＧＥＸ系列载体的构建为了研究ＴＰｃ的促凋亡作用，设计了ｐＧＥＸＴＰｃ表达载体（图１）及ｐＧＥＸＴＯＰｃｍ，ｐＧＥＸＴＯＰｃ和ｐＧＥＸｐ５３ｃ载体。ＴＯＰｃ，ＴＯＰｃｍ，ＴＰｃ和ｐ５３ｃ片段理论大小分别为１６５，１６５，１１４和７２ｂｐ，ＰＣＲ鉴定结果与理论值相符（图２）。２．２　ＧＳＴ融合蛋白的表达纯化与鉴定ＳＤＳＰＡＧＥ检测发现表达蛋白占细菌总蛋白量的２０％左右，主要存在于上清液中。取上清液经ＧＳＴ亲和柱纯化。ＳＤＳＰＡＧＥ检测融合蛋白ＧＳＴＴＯＰｃ，ＧＳＴＴＯＰｃｍ，ＧＳＴＴＰｃ和ＧＳＴＰ５