Western-blot-试剂配制及操作流程(1)

Western-Blot操作流程试剂配制蛋蛋白白提提取取试试剂剂1.RIPA裂解液：50mMTris（MW121.14，PH7.5）3.02g150mMNaCl4.38g1%TritonX-1005ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS0.5g蒸馏水至500ml。调pH值至7.5。混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。2.蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/LPMSFPMSF17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。（2）10mM亮肽素leupeptin:-20℃保存（3）2.1mg/ml抑肽素Aprotinin:4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin1ug/ml（储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。蛋蛋白白定定量量试试剂剂1.G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mgBSA粉末溶于20ml双蒸水，定容至100ml，加少量防腐剂，4℃保存。上上样样用用试试剂剂1．4X上样缓冲液1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）2mlSDS0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。2．1.0mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT,分装成1ml小份储存于-20C。使用时稀释成1X。例如：上样量20μl--4X上样缓冲液5μl+DTT2μl+样本蛋白13μl工工作作液液制胶用（1-6）：1.1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)12.114g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。2.1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)18.671g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。3.10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g蒸馏水1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）：4C保存。6．30%丙稀酰胺：4C保存。10%下层胶（两块胶，15ml）：依次加入去离子水5.9ml30%丙烯酰胺5ml1.5MTris-HCl（pH8.8）3.8ml10%SDS150μl10%AP150μlTEMED6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入去离子水4.1ml30%丙烯酰胺1ml1MTris-HCl（pH6.8）0.75ml10%SDS60μl10%AP60μlTEMED6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。7．5X电泳液缓冲液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。8．10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）9．10XTBS缓冲液Tris（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸馏水至1000ml（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。10．1XTBST缓冲液10XTBS缓冲液100ml1XTBS缓冲液700ml蒸馏水900mlTween-201.65mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：1XTBST缓冲液95-100ml脱脂奶粉5g溶解后4℃保存，可于一周内使用。其他商品性试剂一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，（暂不作可将培养皿存于-80度）。2、向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min3、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）4、超声处理（可选）注意蛋白悬液放于冰上，15sec处理，dutycycle50-60每次处理后清水洗探头、擦干，再作下一个5、于4℃下12000rpm离心5min。6、将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80℃保存。（2）组织中总蛋白的提取：1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上。3.10，000g,4℃,10min,（5ml管）4.取上清至1.5ml管，12，000g,4℃,60min,5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存（二）蛋白含量的测定1、从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。2、取7个5ml离心管，分别加入1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul，用蒸馏水补足各管至100ul。3、样本取5ul，加蒸馏水95ul，使总量亦为100ul，混匀。4、各管加G-250溶液2ml混匀，室温静止2分钟。5、混匀后，在生物分光光度计上比色分析，测定595nm的光吸收，测定时浓度由低到高。6、于Excel根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。（三）SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边）2、按前面方法配10％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层正丁醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去正丁醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。4、等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量），目的蛋白GluT3一般在20-30μl左右。取出上样样品至200μl的EP管中，加入4×上样缓冲液及DTT至终浓度均为1×（上样总体积一般不超过30μl）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性（亦可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了）。5、按前面方法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。7、上样(注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。)Marker6μl（Marker加在最边上的加样孔中）样本20-30μl实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa（3）电泳：电压100V，电流300mA,功率50W，时间1.5hour。(电泳15分钟后可调节电压到130V)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。（四）转膜（1）转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜；硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头；不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；转膜时电极方向注意是膜正胶负。如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1XTBST缓冲液。（五）免疫反应（1）封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。（2）一抗a.用parafilm膜制作与膜大小相同的槽；b.从封闭液中取出膜，1XTBST5minX3次;c.将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT31:300,actin1:2000）；d.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1-2h后（目的蛋白GluT31.5h,actin1h），4度过夜，次日用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。（3）二抗同上方法准备二抗稀释液（目的蛋白GluT31:1000,actin1:1000）并与膜接触，室温下孵育1h后，用1XTBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。（六）化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂等量（常用各500μl）在5ml离心管中等体积混合；打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光），用保鲜膜包好。（2）将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中；在