生理学实验报告

生医2012秋生理学实验报告指导教师：实验员：学号：联系方式：实验一骨骼肌的观察及骨骼肌的单收缩与强直收缩【目标要求】1.掌握蛙类动物单毁髓的实验方法。2.掌握坐骨神经-腓肠肌标本和坐骨神经干标本的制备方法。3.学习肌肉收缩的记录方法。4.观察与分析肌肉单收缩的三个时相，分析骨骼肌收缩形式与刺激频率之间的关系。【基本原理】蛙类动物的某些基本生命活动，如神经的生物电活动、肌肉收缩等与哺乳动物相似。其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握，而且动物来源丰富，因此在生理学实验中常用蟾蜍的坐骨神经—腓肠肌标本永和坐骨神经标本来观察组织的兴奋性、刺激与反应的规律以及骨骼肌收缩的特点等。肌肉受到一次阈上刺激而产生的一次收缩为单收缩，其过程可分为三个时相，即潜伏期、缩短期与舒张期。肌肉收到连续的阈上刺激时，如果刺激间隔小于单收缩的时程，相邻两单收缩的时相会出现融合，表现为强直收缩现象。如果表现为每次收缩的开始发生在上次收缩的舒张期，称不完全强直收缩，如果表现为每次收缩的开始发生在上次收缩的缩短期，称完全强直收缩。躯体运动是以骨为杠杆，以关节为枢纽，由肌肉收缩产生动力完成的。【材料与器械】蟾蜍或蛙，蛙类手术器械（手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、金冠剪、毁髓针、玻璃针、固定针），蛙板，玻璃板，锌铜弓，小烧杯，滴管，纱布，细棉线，任氏液。BL-420生物机能实验系统（或其他生理记录仪），张力换能器。【实验步骤】1.双毁髓的方法一手握蟾蜍，食指按压头部前端，拇指压住躯干背部，令其背部向上，头向前俯；另一手持毁髓针在左右耳后腺之间，背部的凹陷处将毁髓针垂直刺入，然后将针尖向前刺入颅腔，搅动以捣毁脑组织，此时的动物为单毁髓动物。彻底捣毁脊髓时，可见蟾蜍后肢突然蹬直，然后瘫软。如动物仍表现四肢肌肉紧张或活动自如，表明未毁坏脊髓，必须重新毁髓。2.剥制后肢标本将双毁髓的蟾蜍背面向上放在蛙板上，一手持手术镊轻轻提起两前肢之间背部的皮肤，另一手持手术剪横向剪开皮肤，暴露脊柱。用金冠剪横向剪断脊柱。一首持手术镊提起断开的脊柱后端，另一手用金冠剪沿脊柱两侧剪开体壁，再剪断下腹壁肌肉，使头部、前肢及内脏自然下垂，将其自腹后壁剪除。然后用蘸有任氏液的左手捏住断开的脊柱后端，右手向后方撕剥皮肤，将剥干净的后肢放入盛有任氏液的培养皿中。弃其头部、内脏及剥下的皮肤，清洗手及手术器械上的污物。3.分离两后肢左手托起去皮的标本，右手持金冠剪直接剪开耻骨联合，随后剪开两后肢相连的肌肉组织，并纵向剪开脊柱（尾杆骨留在一侧），将标本一分为二，一只继续剥制标本，另一只放入任氏液中备用。4.分离坐骨神经取一侧后肢的脊柱端腹面向上，趾端向外侧翻转，使其足底朝上，用固定针将标本固定在玻璃板下面的蛙板上。用玻璃针沿脊神经向后剥离坐骨神经。沿腓肠肌正上方的股二头肌和半膜肌之间的肌缝找出股部的坐骨神经，坐骨神经基部有一梨状肌盖住神经，用玻璃针轻轻挑起此肌肉，便可看清其深层穿行的坐骨神经。剪断梨状肌，完全暴露坐骨神经，再用玻璃针轻轻挑起神经，自上而下剪去支配腓肠肌之外的其他分支，将坐骨神经游离至腘窝处。用金冠剪剪去多余的脊柱骨及肌肉，只保留坐骨神经发出部位的一小块脊柱骨。取下脊柱端的固定针，用手术镊轻轻提起脊柱骨的骨片，将神经搭在腓肠肌上。5.游离腓肠肌用玻璃针将腓肠肌与胫腓骨分离开，用手术刀片将腓肠肌跟腱与胫腓骨分离开一段，用手术镊在腓肠肌跟腱下穿线并结扎，提起结扎线，剪断跟腱与胫腓骨的联系，游离腓肠肌。6.分离股骨一手捏住股骨，沿膝关节剪去股骨周围的肌肉，用金冠剪刮干净股骨上的肌肉，保留股骨的远端二分之三，剪断股骨。剪去膝关节下部的后肢，保留腓肠肌与股骨的联系。7.检验标本用手术镊轻轻提起标本的脊柱骨片，使神经离开玻璃板，持经任氏液蘸湿的锌铜弓，使其两极轻触神经，如腓肠肌反生收缩，则表示标本机能正常。提起腓肠肌上的结扎线，勿使神经收到牵拉，轻轻将标本放入任氏液中，稳定5-10min，即可用于实验。8.将坐骨神经-腓肠肌标本的股骨部分插入肌槽的固定孔内，拧紧固定螺丝，将坐骨神经放在电极上，将跟腱上的结扎线与张力换能器相连。9.用BL-420生物机能实验系统（或其他类型的生理记录仪）记录单收缩和强直收缩，步骤如下：（1）将张力换能器在肌槽上方与肌槽平行地固定于铁支架上，将标本上的结扎线缚于张力换能器悬梁壁上，将换能器输出的插头连于BL-420生物机能实验系统。（2）将BL-420生物机能实验系统的输出电极连于肌槽电极上。选择采样频率、显示方式、显示通道、时间常数、高频滤波，必要时还要选择50Hz陷波；记录时选择刺激标记。（3）选择单刺激方式，合适的刺激强度、刺激时间、扫描速度、纵向放缩和刺激标记，记录单收缩曲线。记录曲线参考图。（4）选择连续刺激方式，参考单刺激的刺激强度、刺激时间、纵向放缩、刺激标记、调节刺激时间间隔和扫描速度，分别记录不完全强直收缩曲线和完全强直收缩曲线。记录曲线参考图。（5）将记录曲线存盘，根据需要进行剪辑和编辑，最后导出另存或输出打印。【实验记录】分析：刺激电压低于阈上刺激，神经不兴奋，肌肉也不会收缩。当电压达到阈强度，神经开始兴奋，肌纤维才开始收缩。当刺激频率增大时，如果刺激频率小于骨骼肌收缩舒张频率就可以看到数个比较完整的收缩舒张波（从零电位到峰值，再由峰值回到零电位），而当刺激频率大于骨骼肌收缩舒张频率时，骨骼肌一次收缩后还没来得及舒张完全就又受到电刺激重新达到收缩峰值，刺激频率增大到一定强度时就几乎看不到骨骼肌舒张的波形，持续收缩直至僵直。【注意事项】1.双毁髓时应注意使蟾蜍头部前俯，用纱布盖在耳后大腺上，防止耳后腺分泌物射入眼内。如分泌物射入眼内，应立即用生理盐水冲洗眼睛。标本制备过程中应经常滴加任氏液，防止标本干燥。【思考题】1、剥去皮肤的后肢，能用自来水冲洗吗？为什么？答：不能。自来水是低渗溶液，会使肌细胞失水萎缩，影响活性和实验结果。2、金属器械碰压、触及或损伤神经及腓肠肌，可能引起哪些不良后果？答：金属器械碰压神经与腓肠肌，会引起肌肉收缩，如果碰的较重，损伤部位及近端的神经就死亡了，以后刺激只能从损伤处向肌肉处之间的部分。另外容易使标本疲劳，失去活性。3、如何保持标本的机能正常？答：金属器械不要碰及、损伤神经或腓肠肌，保持湿润，常加任氏液，最好先泡一会。实验二蟾蜍离体蛙心灌流【目的要求】1.学习两栖类动物离体心脏的灌流方法，掌握斯式插管法；2.证明心肌具有自动节律性收缩的生理特征；3.观察钠离子、钙离子、钾离子、肾上腺素、乙酰胆碱对心脏活动的影响；4.理解内环境各种理化因素的相对恒定对于细胞进行正常生命活动的重要意义。【基本原理】心脏离体后，仍能有节律地自动收缩、舒张，此为心肌的自动节律性。两栖类动物的心脏没有冠状动脉，心肌细胞直接从心腔中的血液中获得营养物质和氧气，因而可用斯式插管法进行离体心脏灌流。灌流液的成分应同动物内环境的成分基本一致，用于两栖类动物心脏的灌流液为任氏液。始终有任氏液灌流于心腔，离体心脏可长时间地活动，改变灌流液的成分则可引起心脏活动的改变。【材料与器械】蟾蜍或蛙，蛙心套管，套管夹，支架，双凹夹，滑轮，烧杯，常用手术器械，蛙板，蛙心夹，微机记录系统或二道记录仪，张力传感器，滴管，小烧杯，纱布，棉线，任氏液，0.65%NaCl，5%NaCl，2%CaCl2，1%KCl，1/5000肾上腺素，1/10000乙酰胆碱。【实验步骤】1.暴露心脏取一只蟾蜍，用探针破坏脑和脊髓。双毁髓后，将其仰卧于蛙板上。一手持手术镊提起胸骨后方的皮肤，另一手持解剖剪剪开一个小口，然后将剪刀由开口处伸入皮下，向左、右两侧下颌角方向剪开皮肤。将皮肤掀向头端，再用手术镊提起胸骨后方的腹肌，在腹肌上剪开一口，将解剖剪紧贴体壁向前伸入，并沿皮肤切口方向剪开体壁，剪断乌喙骨和锁骨，使创口呈一倒三角形。一手持眼科镊，提起心包膜，另一手用眼科剪剪开心包膜，暴露心脏。在腹面可以看到一个心室，其上方有两个心房。心室右上角连着一个动脉干，其根部膨大为动脉圆锥。动脉干向上分成左、右两支主动脉。用玻璃针从动脉干背部穿过，将心脏翻向头侧。在心脏背面两心房下面，有一个呈紫红色的膨大部分，为静脉窦，是两栖类动物心脏的起搏点。静脉窦连左、右前腔静脉，后连一个后腔静脉；后腔静脉近窦处，有左、右肝静脉汇入。2.离体心脏制备斯式插管法分四步：1）动脉切口：在动脉干分支处下方穿过一线，并打一活结留作固定套管用。在左主动脉下方穿过一线，稍离动脉干分支处结扎。左手提起左主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方近动脉圆锥处、沿向心方向将左主动脉壁剪一“V”斜口。2）套管入室：取一尖端大小适宜的斯式蛙心套管，加入少量任氏液，达套管内2~3cm高度即可。左手用小镊子夹住切口缘，轻轻上提，使切口扩大；右手持蛙心套管，自切口处插入动脉圆锥。然后，左手持主动脉上的结扎线向后拉，右手推送蛙心套管，使之进入动脉圆锥。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进。在心室收缩时，将套管经主动脉瓣间隙插入心室腔内。进入心室后，血液冲入套管，并使液面随心脏波动而上下移动。如果套管没有顺利插入心室，应改变方向慢慢试插，不用蛮力。插入心室后不可插得过深，以免心室壁堵住套管口。3）固定套管：待套管尖端插入心室后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧，再将结扎线固定在套管的小玻璃钩上，以防标本滑脱。用滴管吸去套管中的血液，更换新鲜任氏液。4）游离心脏：先将结扎线上方的左、右主动脉剪断。然后轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置。于静脉窦下方剪断所有的组织，使心脏离体。在结扎和剪断时，切勿损伤静脉窦。用任氏液反复冲洗心室内的余血，使套管内的灌流液中不再有残留的血液。套管内任氏液面高度应尽量保持一致，控制在2cm左右较为适宜。3.固定蛙心标本将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部的肌肉。为了不使灌流液滴到传感器上，将蛙心夹上的系线绕过一个定滑轮与张力传感器相连。4.开启仪器打开计算机采集系统，接通张力传感器输入通道。打开matlab,选择“蛙心灌流”实验。5.实验记录1）记录正常心搏曲线。2）改用0.65%NaCl溶液灌流，并作好加药记号，观察心搏变化。待曲线出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2~3次，待心搏恢复正常。3）向套管内加入2~6滴5%NaCl溶液，作好加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变化。当曲线出现明显变化时应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标记，迅速用新鲜任氏液清洗2~3次，待心搏恢复正常。4）同法向套管内加入1~3滴2%CaCl2溶液，观察并记录心搏的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常。5）向套管中加入1~2滴1%KCl溶液，记录心搏曲线变化。当心搏曲线变化时同法更换灌流液，待心搏恢复正常。6）同法记录套管中加入1~2滴肾上腺素溶液（1/5000）后心搏曲线的变化。7）同法记录套管中加入1~2滴乙酰胆碱溶液（1/10000）后的心搏曲线的变化。【实验结果】实验结果如下：1、正常心搏曲线2、用0.65%NaCl溶液灌流分析：由图可知，Na离子会使心肌活动强度减弱，原因是用NaCl溶液灌注蛙心时，由于灌注液中缺乏Ca离子，以致心肌细胞动作电位2期内流钙离子减少，细胞质Ca离子浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。3、用2%CaCl2溶液灌流分析：细胞外Ca离子在细胞膜上对Na离子内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。钙离子浓度增高时，钠离子内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导性均降低。钙离子浓度增高使钙离子内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，复极加速。钙离子内流增多，使心肌收缩能力增强。钙离子浓度降低时，所引起的变化与高钙时相反。因此加入氯化钙后，心率减少、振幅减少，基线上移。5、用KCl灌流分析：滴加氯化钾后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下降，因为当细胞钾离子浓度增高时，钾离