实验七-植物DNA的提取与纯度鉴定

植物DNA的提取与纯度鉴定谢艳实验七•实验目的•实验原理•实验材料•实验试剂•实验仪器•实验步骤•注意事项实验目的•了解植物总DNA提取的原理•学习和掌握提取、纯化高等植物总DNA的方法和步骤核酸的理化性质DNA和RNA都是极性化合物，一般都溶于水或1mol/L的NaCl溶液中，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。核酸的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。DNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。背景知识1不同生物须选择不同DNA提取方法不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取难易度不同：对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大，一般达2×10道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。背景知识2同一生物不同部位DNA含量不同为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从同一生物的不同的部位提取DNA。但由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。如动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子；植物种子的胚中都含有丰富的DNA。如微生物中，谷氨酸菌体含7%-10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%-10%。背景知识3背景知识4不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。提醒真核细胞基因组提取的方法•浓盐法•离子去污剂法•苯酚抽提法•水抽提法•CTAB法DNA提取基本方法：1.机械法破碎细胞2.去除蛋白质，酚类等细胞内杂质污染3.纯化ＤＮＡCATB法的简析•冷冻和研磨，使细胞破裂•加入CTAB提取缓冲液，溶解DNA•氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白•加入无水乙醇/异丙醇，沉淀DNA•酒精冲洗，去除剩余杂质•RNase消化，去除RNA•无菌水/TE溶解，保存DNACTAB法实验原理•离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，简称SDS)等可以有效裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离。具体•CTAB、SDS等离子型表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚/氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇/无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE或水溶液中，即得植物总DNA溶液。实验材料•烟草嫩叶实验仪器和设备研钵、研棒、水浴锅、高速冷冻离心机移液器及配套吸头、50ml＆10ml量筒1.5ml离心管、50mL离心管实验试剂及其配置1.CTAB抽提液（要求配100mL）试剂需要量/L终浓度CTAB20g2％（w/v）1MpH8.0Tris·Cl100mL100mmol/L0.5MpH8.0EDTA40mL20mmol/LNaCl82g1.4mol/L实验试剂及其配置21MpH8.0Tris·Cl（已有不用配置）121gTris碱溶于800mLddH2O，浓HCl调pH至8.0，补ddH2O定容至1000mL。注意：Tris缓冲液的pH值随温度变化较大，每1℃可引起大约0.028pH单位的变化。实验试剂及其配置30.5MpH8.0EDTA(乙二胺四乙酸)（要求配100mL）29.22gEDTA溶于140mL水中，用固体NaOH调pH至8.0，补ddH2O定容至200mL。作用：EDTA螯合二价离子，抑制DNA酶的活性，保护DNA实验试剂及其配置4CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7MNaCl)（要求配50mL）•CTAB20g•NaCl8.2g•加入160mLddH2O，加热至65℃溶解，补ddH2O定容至200mL，高压灭菌。•注意：此溶液很粘稠，使用时需加热至65℃。实验试剂及其配置•53MNaACpH5.2（要求配50mL）•81.62gNaAC·3H2O/49.22g无水NaAC溶于160mLddH2O中，冰乙酸调pH至5.2，定容至200mL，高压灭菌。•作用：Na离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，使沉淀更完全。实验试剂及其配置•6高盐TE溶液（pH8.0）（要求配50mL）试剂需要量/L终浓度1MpH8.0Tris·Cl10mL10mmol/L0.5MpH8.0EDTA0.2mL0.1mmol/LNaCl58.5g1mol/L作用：DNA保存更稳定实验试剂及其配置•724：1的氯仿（三氯甲烷）/异戊醇（要求配50mL）氯仿变性蛋白质，异戊醇消除气泡注意：混匀过程要轻柔，以免DNA断裂。•875%乙醇（要求配50mL）实验步骤（1）•1、CTAB抽提液65℃预热；异丙醇－20℃预冷；•2、称取新鲜烟草叶片1克，加液氮研磨，共加3-4次液氮；•注意：•(1)研磨时应注意防止液氮冻伤，戴上一次性PE手套；•(2)新鲜的本氏烟较易磨碎，加液氮3-4次；杂草样品特别是不新鲜的杂草样品常较难磨，加液氮4-5次。一般加液氮4次；•(3)加液氮时动作轻柔，否则液氮会将样品冲出而造成样品损失；•(4)磨样过程中，样品不能溶化，样品研磨得越细越好；•(5)每换一个新样品，要换一次PE手套。实验步骤（2）•3、最后一次加液氮磨样后，立即加入预热的CTAB抽提液，每克叶片加入8mLCTAB抽提液，再加入160L2－巯基乙醇（2-Me）（终浓度2％（v/v））。继续研磨待CTAB抽提液溶化后，将研磨液转入50mL离心管；•4、65℃水浴锅温浴0.5-1小时，每10-20分钟摇动一次离心管；同时65℃预热CTAB/NaCl；注意：离心管盖子应轻轻搭在管口，千万不能盖紧，以防加热使盖子冲出，最好离心管壁和盖子同时做好标记。实验步骤（3）•5、加入等体积（约8mL）24：1的氯仿/异戊醇抽提；•注意事项：•（1）氯仿/异戊醇有毒，应戴上PE手套操作且保持室内通风。•（2）1mL移液枪吸取氯仿/异戊醇时，应缓吸缓放，严禁枪头朝上以防氯仿/异戊醇倒灌进枪管而腐蚀枪杆。•（3）加入氯仿/异戊醇，盖紧盖子，按紧离心管两端，上下颠倒4-6次，松手后立即打开盖子，防止管内液体冲出。实验步骤（4）•6、天平平衡离心管，4℃10000rpm离心5分钟；•7、回收水相，将上清小心地转入另一50mL离心管（约8mL）；注意事项：水相底部有大量杂质，用移液枪转移水相时应细致耐心，不能吸入杂质；•8、加入1/10体积（800L）、65℃预热的CTAB/NaCl，混匀。CTAB/NaCl较粘稠，可将枪尖剪去后吸取；•9、加入等体积（8mL）氯仿/异戊醇二次抽提，注意事项同步骤5；•10、平衡离心管后，4℃10000rpm离心5分钟；实验步骤（5）•11、回收水相，将上清小心地转入另一50mL离心管（约8mL），注意事项同步骤7；•12、加入1/10体积（800L）3MNaAC，混匀；•13、加入等体积（8mL）－20℃预冷的异丙醇，－20℃放置0.5-1小时；•14、4℃12000rpm离心15分钟；•15、弃上清，2mL75％乙醇洗涤沉淀一次；实验步骤（6）•1６、12000rpm离心2分钟，轻轻地吸出75％乙醇，将离心管反扣在干净的吸水纸上将乙醇吸干；注意：枪头不要吸到沉淀•1７、37℃烘干10-15分钟；注意：DNA烘干过程中应注意观察，以DNA较饱满且四周见不到明显的水滴为宜，如DNA呈纸状贴在管壁上，则烘干过分，会造成DNA难以溶解；•1８、加入200-500LＴＥ溶液溶解；注意：如DNA难溶，可37℃水浴数分钟；实验步骤（７）•１９、加入2LRNAase（10g/L）3~4L，混匀，37℃水浴消化30分钟；注意：所提DNA可用于Southern杂交，如仅用于PCR扩增，此步骤可省；•2０、DNA纯度鉴定植物DNA的纯度鉴定•提取得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量原理：核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰OD260/OD280=1.7-1.9OD260/OD2302.01OD260=50μg/mLDNA1.6蛋白质含量过高；2.0样品中污染RNA，或DNA降解植物DNA的纯度鉴定方法（1）1.DNA溶液稀释20-30倍后，紫外分光光度计测定OD260/OD280比值,明确DNA的含量和质量；2.取2-5μl在0.８%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小；DNA样品在0.8%Agarose胶上电泳（例图）植物DNA的纯度鉴定方法（2）植物DNA的纯度鉴定方法（3）•3.取2μgDNA,用10单位HindⅢ酶切过夜,0.7%agarose胶上电泳,检测能否完全酶解（做RFLP，DNA必须完全酶解）。•如果DNA中所含杂质多，不能完全酶切，或小分子DNA多，影响后续的分析和操作，可以用下列方法处理：•（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量；•（2）酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖；•（3）柱子过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA；•（4）氯化铯梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA（可用作文库构建）。凝胶电泳鉴定植物DNA的纯度•取2-5μl在0.８%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小及纯度1每组配制0.８%agarose胶1块；2取3ulDNA抽提液上样，电泳半小时；3紫外下观察结果试验要求