临床PCR检验的室内质控2017版-李金明

临床PCR检验的室内质控方法卫生部临床检验中心李金明2017年10月存在的问题概念不清不知道具体怎么做不会写室内质控的SOP不知道如何选择室内质控物不会分析室内质控的结果室内质控SOP存在的问题责任人不清。质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。没有明确所选用的质控方法。对前20次的测定的室内质控没有解决方法。没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。并且一般都没有阴性失控的判断方法。没有失控后的分析及处理措施。室内质量控制（InternalQualityControl,IQC)的概念由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。室内质量控制（IQC）的基本内容主要包括三个方面：（1）测定前的质量控制；（2）统计学质量控制；（3）质量控制的评价。测定前的质量控制实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法人员培训实验室设施、仪器设备及管理实验室空间及工作流程的设计实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源理想的PCR实验室设计A产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区理想的PCR实验室设计B临床PCR实验室设计的一般原则各区独立注意风向因地制宜方便工作“十六字口诀”产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗临床PCR实验室质量管理的特点“无基因”概念实验室要有严格的人员进入限制和程序使用合格的试剂和消耗品PCR实验室“污染”的主要来源临床标本中存在的大量待测微生物科研中得到的质粒克隆以前分析研究的特定微生物大量存在于实验环境中的特定微生物以前扩增产物的残留污染。这也是PCR实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。PCR实验室的重要防“污染”措施实验室的严格分区及工作程序的严格遵守化学方法：实验台面可使用10％的次氯酸钠（漂白剂）清洗；有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时，在转回之前，应将其置于2％~10％的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。紫外照射：实验台面、仪器设备、实验室空间UNG仪器设备及管理PCR仪、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案，并定期维护;PCR仪、加样器、恒温设备应定期进行校准理想的试剂:试剂的质检核酸提取或标本处理方法的抗干扰能力（能否有效地去掉PCR抑制物）测定下限(Detectionlimit)（定性测定）测定准确性和线性范围批内变异和批间变异试剂批间的一致性有否污染其他：外包装、试剂的完整性、有效期、说明书等理想的操作方法按照试剂盒说明书操作即可吗?操作中影响测定结果的关键环节写出具有可操作性的SOP人员培训培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。统计质控方法质控物浓度的选择每次（批）测定质控物的数量及放置质控规则Levey-Jennings质控图方法“即刻法”质控方法“假阳性”的统计质控方法质控物浓度的选择定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度定性测定：接近方法测定下限的浓度阴性质控物每次（批）测定质控物的数量及放置标本数量如小于30，弱阳性和阴性质控各1份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取）扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。阴性质控样本的种类阴性原血清样本实验过程中带入的空管仅含扩增反应混合液的管阴性原血清样本的功能监测实验室的以前扩增产物的“污染”由实验操作所致的标本间的交叉污染。具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等扩增反应试剂的污染。核酸提取过程中带入的空管监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在（在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增）仅含扩增反应混合液的管监测试剂的“污染”质控规则的表达方式及定义质控规则的表达方式质控规则的功能常用质控规则的符号及定义质控规则的表达方式通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值±1～3SD来表示。当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值±3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值±3s范围，即可将该批测定判为失控。质控规则的功能简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。常用质控规则的符号及定义符号定义12S一个质控测定值超出±2s控制限。13S一个质控测定值超出±3s控制限。22S两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。R4S同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限。41S四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。7T七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。10X十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。Levey-Jennings质控图方法也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。质控图Levey-Jennings质控图基本的统计学含义稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以±3s为失控限，假失控的概率为0.3%。“即刻法”质控方法“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，即Grubs异常值取舍法；只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。“假阳性”的统计学室内质控方法基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布)直接概率计算方法（不呈正态分布）基于日常检验的阳性率比值半Levey-Jennings质控图法质控规则当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性质控样本。如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+3SD,则为失控,为1+3S规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况,决定是否可以发出,所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因，并在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。可能的几种失控表现曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等向上的趋势性变化：可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验室需要进行彻底清洁。直接概率计算法按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被称为小概率事件，即发生的可能性很小。当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在，有必要对其发生的原因进行分析。对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于5%时，则可判为失控。根据二项式分布的概率计算在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为p,计算在n个血液样本中有k个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算公式如下：P(X=k)=n!/[k!(n-k)!]pk(1-p)n-k(1)其中n为当次实验检测标本数，k为阳性个数，p为阳性率。P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。根据二项式分布的概率计算如果一个实验室检测HBVDNA，平常病人结果的阳性率为10%，即p=0.1,在某一次检测25个样本出现6个阳性结果，19个阴性结果，则检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在25个样本中出现6个或6个以上阳性结果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4个或多5个阳性结果的概率）即：1-[P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)]=1-[(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15]=0.0334则在这个实验室一次检测25个标本获得6个或6个以上阳性结果的概率为3.34%，小于5%，属于小概率事件，即发生的可能性很小，可能有污染所致假阳性结果的可能。根据泊松分布的概率计算在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目如HCVRNA、CT、结核杆菌、淋球菌的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更为简便的方法。。根据泊松分布，可使用下式计算概率：P(X=k)=(np)ke-np/k!(2)P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。根据泊松分布的概率计算一个实验室中，某项目每次检测结果的阳性率约为2%，则在100个样本中出现8个阳性结果的概率。根据泊松分布，可使用公式（2）计算概率，此时n=100,p=0.02,k=8,np=2代入公式（2）计算得P(X=10)=28e-2/8!=0.0009。标本间交叉污染的概率计算如果所有阳性结果的出现是连续性的，则可能存在标本间的交叉污染，即阳性样本污染了它邻近的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下：P=(n-r+1)/[n!/r!(n-r)!]（3）其中n为当次实验检测标本数，r为连续出现阳性的个数。当某次实际测定标本连续阳性的概率大于所计算的概率，则判为失控。阴性标本结果可以发出，阳性标本要考虑标本间交叉污染的问题。标本间交叉污染的概率计算如在一次检测100个标本的HBVDNA检测中，所有两个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-2+1)/[100!/2!(100-2)!]=99/4950=0.02概率为2.0%。因此，如在100个标本中，连续出现两个为阳性次数有3次，即概率为3.0%，则为失控。而在一次检测100个标本，所有三个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-3+1)/[100!/3!(100-3)!]=98/161700=0.0006概率为0.06%。因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有1次，即概率为1.0%，为失控。室内质量控制的评价IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。IQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。对IQC应定期进行评价。阳性质控样本失控的常见原因核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留、所用耗材如离心管有P