禽病实验室诊断

禽病诊断河南农业职业学院动物科学系闫民朝TEL：13783552941实验室诊断一、血清学试验(一)凝集试验1.直接凝集试验凝集反应即细菌、红细胞(Hb)等颗粒性抗原与相应的抗体在电解质参与下,抗原颗粒相互凝集形成团块,这种现象称为凝集反应。参与反应的抗体称为凝集素,抗原称凝集原。常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集法等。(1)平板凝集试验取洁净玻板一块,用蜡笔按试验要求划成数个方格,并注明待检血样的号码;用生理盐水倍比稀释血清,加入抗原,用牙签(或火柴棍之类)自血清量最少(血清稀释度最高)的一格起,将血清与抗原混匀,注意抗原用前摇匀,并置室内,使其温度达20℃以上。混合完毕用酒精灯稍微加温,使达30℃左右,5~8min内记录结果。按下列标准记录反应强度：＋＋＋＋:出现大的凝集块,液体完全透明。＋＋＋:有明显凝集片,液体几乎完全透明,即75%凝集。＋＋:有可见凝集片,液体不甚透明,即50%的凝集。＋:液体混浊,有小的颗粒状物,即25%凝集。－:液体均匀混浊,即不凝集。该法为一种定量方法,常用于检测待检血清中的相应抗体及其效价。如一般以＋＋以上血清最高稀释度为该血清的凝集价。也用定性作为禽病阳性判定,协助临床诊断及流行病学的调查。注意：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。(2)试管凝集试验既可用已知抗原(细菌混悬液)检测待检血清,又可用阳性血清检测待检抗原。①每份血清用4支试管,另取3支对照管。②用0.5%石炭酸生理盐水将被检血清稀释成四个稀释度。第5管中不加血清,设为抗原对照。第6管中加1:25稀释的阳性血清0.5ml个阳性血清对照。第7管中加1:25稀释的阴性血清0.5ml作为阴性对照。③各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍的抗原0.5ml,并充分混匀。④放入37℃下作用4~10h,取出后放室温18~24h观察并记录结果。试管凝集试验操作示意表单位:ml管号1234567最终血清稀释度1:251:501:1001:200抗原对照阳性对照1:25阴性对照1:250.5%石炭酸生理盐水2.30.50.50.50.5--}}}}弃去0.50.20.50.50.5-0.50.5被检血清抗原(1:20)0.50.50.50.50.50.50.5弃去1.5放入37℃温箱中作用4~10h,取出后放室温18~24h观察并记录结果弃去1.5(3)玻片凝集法又称快速凝集反应,为一种定性试验,常用于鸡白痢的诊断及流行病学的调查中,也用于鸡传染性鼻炎,鸡慢性呼吸道病(霉形体病)等的诊断。现以鸡白痢玻片凝集试验为例进行示范说明：用滴管吸取标准诊断液(即鸡白痢凝集标准抗原)一滴(约0.05毫升)滴在洁净的玻片或干净普通玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉或剪一鸡冠齿,采血一滴(约0.04毫升),使之与诊断液混匀,可用牙签或火柴棍搅匀,或稍微靠在桌边缘摇动玻片,频频变动玻板水平位置,使混合均匀。如在1~3min内细菌和红细胞从混合液滴的边缘开始逐渐凝集成较大的颗粒,呈片状、团块状,将红细胞凝集成许多小区,液体几乎完全透明,外观是花斑状,则判为阳性反应;如在2~3min之内不出现凝集现象,而且玻板上的混合液均保持原来的状态,或者中间部分较浓,四周较稀薄的混悬物,则可判为阴性反应。该反应温度条件在室温20~30℃进行。类似的还可用血清进行快速凝集反应,其方法为选用洁净玻片或载玻片,下面衬以黑色展板,在玻片上滴一滴血清或相当凝集价的稀释血清,再滴一滴鸡白痢凝集标准抗原(诊断液)混合均匀,几分钟后观察凝集成块情况,判定阴阳反应。如阴性反应,则混和液保持一致混浊的红色。(4)微量凝集法该方法原理均同试管凝集法,只是操作在微量滴定板(反应板)上进行,抗原、抗体用量很少,故称微量凝集试验,即用数根稀释棒并排在Ｕ型或Ｖ型微量滴定板上揉搓,将待测血清作系列倍比稀释,随后滴加抗原振荡混合,置37℃温箱或温室内一定时间(12~24h),判定结果方法同平板法。2.间接凝集试验即将颗粒性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关的小颗粒(载体)的表面,此吸附抗原(或抗体)的载体颗粒与相应的抗体(或抗原)结合,在有电解质存在的适宜条件下发生凝集现象。亦称被动凝集试验,常用的载体有动物的红细胞,聚苯乙稀乳胶活性炭等,吸附抗原后的颗粒称为致敏颗粒。现将最常用的间接血凝试验介绍如下：间接血凝试验是以红细胞为载体,将抗体(或抗原)吸附在红细胞表面,用来检测微量的抗原(或抗体),吸附有抗体(或抗原)的红细胞也称致敏红细胞。间接血凝试验目前多采用微量法,可选用Ｕ型或Ｖ型微量反应板,将待检血清在血凝板试验用的反应板上用稀释棒或定量移液管作倍比稀释,再加等量致敏红细胞悬液,振荡混匀后,置于一定温度数小时或于25~30℃放置过夜,观察凝集程度。以出现50％凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝价。试验应设如下对照:①致敏红细胞加稀释液的空白对照;②已知阳性血清对照;③已知阴性血清对照;④未致敏红细胞加阳性血清对照。(二)免疫琼脂扩散试验(AGP)抗原与相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中会自由扩散,形成肉眼可见的沉淀带称为免疫琼脂扩散试验(沉淀试验)。可用已知抗原沉淀未知抗体,也可用已知抗体测定未知抗原,特异性强,可用于禽流感(AI)、禽霍乱、鸡白痢、马立克(MD)、传染性法氏囊炎(IBD)、传染性支气管炎(IB)、传染性鼻炎(IC)、传染性脑脊髓炎(AE)、病毒性关节炎(REO)、鸡包涵体肝炎(IBH)等的诊断。1.琼脂的制备方法琼脂凝胶中含1%的优质琼脂粉、0.1%石炭酸、8%NaCl,水浴加热至全溶,分装于三角瓶中,于4℃条件下冷藏备用。用前将其置入沸水浴中融化,待温度下降至50~60℃时倒入培养皿中(或玻片上),厚度为3~5mm。然后打孔(孔直径4mm,孔距3~4mm)。结束后在火焰上轻轻烘烤(封底),即可加样。2.操作方法：用已知抗原测定血清抗体时,中央孔加入已知抗原,1、4孔加阳性血清对照,2、3、5、6孔加待检血清;用已知阳性血清测未知抗原时,中央孔加已知阳性血清,1、4孔加已知抗原对照,2、3、5、6孔加待检抗原材料(加满即可,不可外溢)。然后加盖,置于37℃恒温箱中反应24~48h后观察。3.结果判定：阳性者在两孔之间会出现一条肉眼可见的沉淀带。阴性者无此现象出现。1.抗原抗体分子量相同,浓度也相同。2.抗原分子量小扩散系数大浓度相同。3.抗体分子量小。4.分子量相同,但抗原浓度高。5.抗原分子量高且浓度高。6.抗原浓度高,抗体分子量小。(三)血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)1.原理正副粘病毒科的病毒(如ND、AI、IB、EDS-76等)可凝集红细胞,而特异性抗体可抑制这种凝集,即凝集抑制。2.HA的操作方法:①1~12孔先加50μLpH为7.2的0.01mol/LPBS液或生理盐水;②第1孔中加入50μL抗原(如ND病毒)振荡混匀;③逐级稀释至第11孔时弃去50μL,第12孔不加抗原,做为红细胞对照;④1~12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50μL,振荡15~30s,使其混匀,静置于37℃作用20~40min观察结果;⑤待对照孔中的红细胞全部沉入孔底中间,即可判定各孔的红细胞凝集情况,以病毒最大的稀释度孔出现100%凝集现象者为这个病毒的凝集价,即一个血凝单位。HA试验操作示意表单位:μl孔号123456789101112抗原稀释倍数Hb对照稀释液505050505050505050505050抗原5050505050505050505050振荡片刻,使其混匀0.5%红细胞505050505050505050505050振荡15~30s,37℃作用20~40min判定举例++++++++----弃去503.HI的操作方法:①1~11孔先加25μL稀释液;②1孔中加入25μL待检血清(或已知阳性血清);③逐级稀释至第10孔时弃去,第11孔不加血清,为阴性对照第12孔不加血清和抗原,为红细胞对照;④1~11孔各加25μL4单位抗原,振荡30秒,37℃作用20min;⑤1~12孔各加0.5%红细胞悬液,振荡1min,37℃作用20~30min观察结果;⑥待第11抗原对照孔的红细胞均匀铺在管壁上(100%凝集)时,检查孔中完全不凝集为该血清的血凝抑制价。HI试验操作示意表单位:μl孔号123456789101112血清稀释倍数抗原对照Hb对照稀释液252525252525252525252550弃去25被检血清252525252525252525254单位抗原2525252525252525252525振荡30s,37℃作用20min0.5%红细胞252525252525252525252525振荡1min,37℃作用20~40min判定举例------+++++-4.HA和HI试验的应用①用于AI、ND、IB、EDS-76等病毒的鉴定这些病毒都能使家禽的红细胞发生凝集,然后用特定的抗体来抑制,若出现凝集抑制则可确定是该种病毒。②HI试验可用于发病禽群的诊断比如用ND疫苗免疫过的鸡群中,ND抗体水平为7~8lg2,最高不超过10lg2,其群体中抗体水平呈正态分布,10lg2以上的仅占10%以下,4lg2以下的仅占1%。而被ND强毒感染并发病的鸡群中,HI抗体可高达11~13lg2,并且鸡群中的抗体水平不呈正态分布,10lg2以上的占25%,4lg2以下的占10~30%。同时结合其它诊断方法以确诊。③可以进行抗体检测可检测家禽的血清抗体或卵黄抗体(母源抗体),对禽群的免疫状态进行评价,以指导免疫。首次进行ND免疫时,母源抗体(半衰期为5d)水平应在3lg2时进行,以后再免时应在4~5lg2之间时进行,过高时则会产生免疫干扰,过低则易发病。④可检测抗体效价可检测高免血清或高免卵黄的抗体效价,从而对其进行质量评价。高免血清或高免卵黄的抗体效价在9lg2以上时,才可用于传染病的紧急预防或发病早期的治疗。(四)红细胞吸附和红细胞吸附抑制试验又称红血球吸附和红血球吸附抑制试验。某些病毒如鸡痘病毒、正、副粘病毒等,在培养的细胞内增殖后,可使培养的细胞吸附某些动物的红细胞,而且只有感染细胞的表面吸附红细胞,不感染的细胞不吸附红细胞,因此可以作为这种病毒增殖的衡量指数。红细胞吸附现象也可被特异抗血清所抑制,故可作病毒的鉴定方法,尤其对一些不产生细胞病理变化的病毒,不失为一种快速有效的鉴定方法。操作方法：细胞经培养长成单层后,常规接种病毒,经一定时间培养,弃培养液,加0.4~0.5%已洗涤的红细胞悬液,置室温(18~20℃)作用一刻钟(某些病毒置4℃或37℃);加少量生理盐水,轻轻洗涤,去未吸附的红细胞,放在低倍显微镜下观察。如红细胞粘附于单层细胞中的感染细胞表面,病毒大量增殖时,可见整个单层细胞粘满红细胞,则均判为阳性。进行抑制试验时,用Hank's液将经病毒接种培养后的培养液洗涤2次,然后加入1:10稀释的抗血清,室温或37℃30分钟后,弃血清,加入红细胞悬液,如上进行红细胞吸附试验,镜检红细胞吸附强度,与对照相比,完全抑制为阳性。附：Hank’s(汉克斯氏)液：原液甲1:NaCl160g,MgSO4·7H2O2g,KCl8g,MgCl2·6H2O2g,按顺序加入到800ml双蒸溜水中,一物溶解后再加另一物。原液甲2:CaCl22.8g溶于100ml双蒸溜水中。以上两液混合,加双蒸溜水达1000ml,加2ml氯仿防腐,保存于5℃。原液乙1:Na2HPO4·12H2O3.04g葡萄糖20gKH2PO41.20g按顺序加入到800ml双蒸溜水中。原液乙2:0.4%酚红液100ml(0.4%酚红液将是0.4g酚红置乳钵中,边研磨边涂加入0.1N的NaOH11.8ml;酚红应完全溶解,置于100ml量杯中,最后加双蒸水至100ml)。将酚红液与葡萄糖等混合液混合,加双蒸溜水至1000ml,加入2ml氯仿防腐,保存于5℃。按下列方法配成汉克斯氏液:原液甲1份,原液乙1份,双蒸溜水18份,此液在5℃下可存1个月。使用前以1.4%NaHCO3(9磅10min灭菌过),无菌操作,校正pH到7.4(依需要定),大约每2