金纳米颗粒的合成

苏州大学本科生毕业设计（论文）1目录摘要.............................................................2Abstract..........................................................41.引言...........................................................51.1.传统实验方法...............................................51.2.基于纳米颗粒的实验方法.....................................51.3.FRET和NSET................................................51.4.捕光材料—共轭聚合物.......................................61.5.实验机理...................................................71.5.1嵌入染料TO.........................................................71.5.2阳离子共轭聚合物PFP..............................................71.5.3实验过程............................................................92.实验部分.......................................................92.1.实验材料...................................................92.2.表征......................................................102.3.金纳米颗粒的合成..........................................102.4.金纳米颗粒的表面功能化...................................1112.5.金纳米颗粒表面DNA的固定..................................122.6.表面固定DNA的GNPs的杂化.................................12苏州大学本科生毕业设计（论文）22.7.TO和PFP的NSET实验......................................122.8.一个碱基不匹配的双链DNAS1核酸酶切反应的分析.............133.实验结果及分析...............................................133.1.以CPPs/GNPs/dsDNA复合物进行的核酸酶探测..................133.1.1.PFP量的优化...........................................133.1.2.GNPs-DNA量的优化......................................143.1.3.S1核酸酶探测..........................................163.2.以CPPs/TO/GNPs-dsDNA复合物进行的核酸酶探测...............163.2.1.PFP量的优化...........................................173.2.2.S1核酸酶探测...........................................183.3.用PG作为荧光探针.........................................19结论............................................................21参考文献........................................................22致谢..........................................................24摘要苏州大学本科生毕业设计（论文）3我们使用共轭高分子/金纳米颗粒/染料标记的DNA复合物发展了S1核酸酶的一种新型检测方法，此方法利用了金良好的荧光淬灭性质和共轭高分子的信号放大特性。这种方法是由于纳米材料表面能量转移（NSET）中，能量从供体分子到纳米颗粒表面的转移遵循可预测的约为70-100nm的距离。在此过程中，由于从共轭高分子到嵌入染料进而到金纳米颗粒表面的NSET，不存在S1核酸酶的情况下将观察不到嵌入染料的荧光信号。而存在S1核酸酶的情况下，双链DNA被切离金纳米颗粒的表面，NSET过程中断，从共轭高分子到嵌入染料高效的荧光共振能量转移所得的嵌入染料的荧光得以恢复。关键词S1核酸酶分析，共轭高分子（CP），金纳米颗粒（GNPs），DNA，信号放大，纳米材料表面能量转移（NSET），荧光共振能量转移（FRET）苏州大学本科生毕业设计（论文）4AbstractAnewstrategyforS1nucleaseassayhasbeendevelopedusingconjugatedpolymer/goldnanoparticle/dye-labeledDNAcomplexbytakingadvantageofgoodfluorescencequencherofgoldnanoparticlesandtheamplificationfeatureofconjugatedpolymer.Thismethodisbasedonnanomaterialsurfaceenergytransfer(NSET)whichenergytransferfromadonormoleculetoananoparticlesurfacefollowsapredictabledistanceaslargeas70-100nm.Inthisprocess,nosignalofintercalateddyewasobservedintheabsenceofS1nucleaseduetotheNSETfromconjugatedpolymertointercalateddyeandfurthertothesurfaceofgoldnanoparticles.InthepresentofS1nuclease,dsDNAwascleavedfromgoldnanoparticleswhichintermitNSETprocess,thusrecoveringthefluorescenceofintercalateddyethroughefficientfluorescenceresonancetransfer(FRET)fromconjugatedpolymer.KeyWordsS1nucleaseassay,conjugatedpolymer(CP),goldnanoparticles(GNPs),DNA,signalamplification,NSET,FRET.苏州大学本科生毕业设计（论文）51.引言实时高选择性及高敏感的酶检测方法对于科研和经济都是非常重要的。DNA酶切反应，如限制及非限制酶参与了许多重要的生物进程，如复制，重组和修复。此外，环境中DNA和酶的相互作用可能会导致遗传信息的改变进而引起健康问题。[1-5]1.1.传统实验方法传统方法已被建立用于测定核酸酶的活性，其中包括凝胶电泳，高效液相色谱法（HPLC），电化学研究和酶联免疫吸附实验。[6]然而这些方法具有如下缺点，耗时，耗DNA，不连续，费力，而且通常需要同位素标记。为了避免这些限制，近几十年来基于荧光共振能量转移（FRET）或非荧光共振能量转移淬灭机理的核酸酶分析方法得以发展。[7-10]1.2.基于纳米颗粒的实验方法基于纳米颗粒NPs的实验方法已被广泛应用于化学及生物探测。纳米颗粒能用作许多量子点及染料分子封装载体，已被主要用于荧光免疫分析的信号记录以提高检测灵敏度。因为纳米颗粒NPs具有大的表面积及球形形状。DNA探针在其表面的固定具有高浓度。此外，NPs悬浮液所提供的几乎均质的环境可促进DNA的固定及杂交。[15]然而，由于洗涤步骤中荧光分子的泄露，基于NPs的生物标记方法的潜在应用受到限制。加之染料掺杂的NPs通常具有宽的发射波和较小的斯托克斯位移，这将导致激发和发射信号间的交互调制。引入荧光共振能量转移（FRET）将供体激发和受体发射间的波长分离开是避免这些缺陷的一种有效方法。[34]由于荧光团能通过有效的非辐射能量转移在金球表面淬灭，基于荧光共振能量转移现象，金纳米颗粒AuNPs已被应用于实验中。由于胶体金具有很强的淬灭能力，其具有大的摩尔消光系数（10-20nm金球约为105cm-1M-1）和有机染料纳摩尔亲和力。1.3.FRET和NSET存在另一种分子的情况下，荧光分子的激发能量可被转移到另一临近的分子上，从而苏州大学本科生毕业设计（论文）6发光。这种现象称为能量转移。典型的能量转移机理是福斯特共振能量转移。FRET是激发态供体通过远距离偶极相互作用将能量转移到近基态受体的一种无辐射过程。[11]尽管具有可观的前景，这种利用FRET机理的方法的距离受到偶极机制性质的限制，从而限制了距离的尺度。最近几个研究组报道了纳米材料表面能量转移（NSET）技术能够测量约为FRET两倍的距离，其中能量从供体分子遵循可预测的距离转移到纳米颗粒表面。使用金纳米颗粒作为能量转移的受体时，NSET和FRET有两方面的不同：(1)与距离的关系从1/R6变化为1/R4，延长了可用的测量距离；(2)同一种纳米颗粒可以淬灭不同发射频率的染料，可见范围横穿到近红外区。因此，NSET可用于距离超过10nm或需淬灭多种染料的研究中。单一纳米颗粒能够同时淬灭多个具有不同能量的染料，从而在单一实验中进行多个距离的分析。[13]1.4.捕光材料—共轭聚合物共轭聚合物（CPs）具有离域结构，有利于光电部分的电子耦合，同时高效的分子间及分子内能量转移引起了荧光信号放大。[16-18]这种光放大的原因是共轭高分子具有长的由很多重复单元组成的高分子链。无论从哪里激发聚合物，激发能量将沿高分子链迁移直至能量转移到邻近的受体（图1.1）。图1.1.通过荧光共振能量转移使用共轭聚合物作为放大信号的捕光分子因此，使用共轭聚合物作为化学或生物传感原件已经获得了强烈的研究兴趣，尤其是在生物分子如核苷酸和蛋白质的敏感的光学检测方面。[19-24]最近，王等人报道了量热苏州大学本科生毕业设计（论文）7法及基于FRET使用阳离子共轭聚合物/DNA复合物用于核酸酶放大分析的荧光方法。[25,26]尽管经证实这些实验方法是可靠，灵敏，方便的，由于需使用荧光标记的DNA仍受到限制。1.5.实验机理考虑到传统方法的缺陷，如耗时，耗DNA，不连续，费力及通常需要同位素标记，提出了基于FRET的核酸酶分析方法。然而检测的长度受到偶极机理性质的限制。此外，由于需要荧光标记的DNA，而这是不利于检测的，量热法和基于FRET使用阳离子共轭聚合物/DNA复合物用于核酸酶放大分析的荧光方法受到限制。因此，我们提出了一种新的概念，利用共轭聚合物/金纳米颗粒/染料标记的DNA复合物进行具有灵敏性，可信度及统一平台的无标记核酸酶活性检测，以此攻克这些缺陷。通过使用GNPs（金纳米颗粒）这种检测系统扩展了测量距离，同时通过直接将发色团嵌入DNA结构攻克了需使用荧光标记的缺陷，从而获得了无需标记