流式细胞术实验方法及应用

流式细胞术实验方法及应用何玉萍科研型分选功能488nm激光四色荧光(525、575、610、675nm）OurweaponOurweapon：：EPICSALTRAFlowEPICSALTRAFlowCytosorterCytosorter一、流式细胞术的原理流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。FreqFluorescenceFALSSensor侧向散射，荧光信号前向散射激光FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管近30年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。二、流式细胞术的特点、优点速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。灵敏度高荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于600个(如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um颗粒。分选感兴趣的细胞纯度达99%，收获率可达90%。流式细胞术的应用范围细胞大小细胞表面分子:CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度常用荧光素激发光波长（nm）发射波长(nm)异硫氰酸（FITC）488525（绿）藻红蛋白（PE）488575（橙）碘化丙啶（PI）488610（红）藻红蛋白偶联物（PE-CY5）488667（红）藻红蛋白偶联物（PE-CY7）488767（红外）别藻青蛋白（APC）633660（红）别藻青蛋白偶联物（APC-CY7）633767（红外）三、单克隆抗体标记荧光探针选择1.了解激发光波长和发射波长2.要有高的光子产量---提高信号强度。3.对激光有强的吸收----降低背景噪音。4.激发光谱和发射光谱之间差距大---减少干扰。5.易与被标记的物质结合，而不影响被标记物的特异性。6.稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂等影响。常用荧光探针组合细胞表型分析：双色分析：FITC与PE三色分析：双色分析+PE-CY5四色分析：三色分析+ECDDNA含量分析：PI凋亡与坏死分析：凋亡用AnnexinV-FITC/PI双染四、标本的收集、单细胞悬液的制备骨髓、外周血、细胞株、组织器官、胸水、腹水、尿液脱落细胞等1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记，再溶血。单细胞的分离制备分离液血液+生理盐水离心2500r/min，20-30min单个核细胞单核细胞:利用单核细胞在短时培养贴壁快的特性（30-40min），可采用短时培养获得较纯的单核细胞.2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)培养板吸去培养液PBS洗2次胰蛋白酶37℃，室温，3-5min含血清的培养基吹打PBS洗2次单细胞悬液。3.组织器官单细胞悬液的制备酶消化法组织器官单细胞制备仪剪碎法机械法网搓法研磨法（1）、酶消化法组织块洗去血液剪成小块胰蛋白酶37℃，15-30min含血清的培养基100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。（2）、机械法单细胞制备仪组织块洗去血液剪成小块制备仪2-3min100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。剪碎法组织块洗去血液剪至浆状吸管轻轻吹打100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。网搓法组织块洗去血液100目钢筛网轻搓生理盐水收集滤液300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。研磨法组织块洗去血液研磨器研至匀浆100目钢筛网300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液。4.石蜡包埋组织单细胞悬液的制备醇乙脱水：70％→80%→90％→95%→100%醇乙→二甲苯→石蜡包埋脱蜡水化：二甲苯脱蜡→100％醇乙→90%→80%→70％→50％→蒸馏水手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。石蜡包埋组织制备单细胞悬液石蜡包埋组织切片二甲苯脱蜡1-2天水化乙醇，蒸馏水组织器官胰蛋白酶37℃，15-30min冰PBS100目钢筛网过滤300目尼龙网过滤离心1000r/min，5minPBS洗2次单细胞悬液5.脱落细胞单细胞悬液的制备包括：尿液脱落细胞胸水、腹水脱落细胞冲洗液脱落细胞收集胸水、腹水、尿液、冲洗液置4℃冰箱中沉淀取底部10-20mlPBS洗3次300目尼龙滤网过滤单细胞悬液收集方法、沉淀时间胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml肝素液，置于4℃冰箱中静置6-12h尿液：收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h冲洗液：300-500ml生理盐水冲洗膀胱，冰箱内置6-12h五、荧光标记主要包括间接免疫荧光染色和直接免疫荧光染色两种方法。间接标记是采用特异的无荧光标记的一抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原--抗体--抗体复合物。其操作复杂、费时，目前很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直接抗体，只能采用此方法。直接标记是在标记时加入连接着荧光素的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用于各实验室。羊抗兔兔抗小鼠小鼠直标间标根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内抗原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例）全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵育15-30min→溶血素→室温10min→PBS洗1次→上机分析（1%多聚甲醛固定）。2.细胞浆或核内抗原标记法收集单细胞悬(1×106)+固定剂A室温，15min洗涤去固定液破膜剂B及抗体室温，15minPBS洗涤1次上机分析（1%多聚甲醛固定）。3.细胞表面和细胞内抗原同时标记在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。常见细胞破膜剂：0.05%皂角素、0.1%曲拉通(TritonX-100)、70%乙醇、商品化固定破膜剂（A、B）。1、空白对照用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验2、阳性染色对照用现有试剂和方法检测已知表达某种特异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时，可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细胞。六、荧光染色对照设置(空白对照、阳性对照、阴性对照、同型对照)3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。4.同型对照与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE七、荧光补偿流式细胞分析中常需要两种或两种以上不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补偿。八、数据分析流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意门和四象门等。任意门、矩形门线性门四象门多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。淋巴细胞T淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-IFN-rIL-4（CD4+）数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为单参数直方图和双参数散点图。参数的意义:FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，散射光越强，细胞越小,散射光越弱;SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映细胞颗粒性程度大小。单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数；双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.SSCFSC九、流式细胞术的应用及标记方法1、DNA含量分析意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的增殖状态及细胞周期分布。正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C）G2/M期（4C）。2C2C→4C4CFCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比。FCM分析一个细胞群周期与DNA倍体时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1、S、G2/M三个细胞峰。G2/M(4C)G0/G1(2C)S(2C→4C)G2/M(4C)方法：细胞悬液（1*106）70%冰乙醇4ºC，24h离心去固定液PBS洗2次RNase30minPBS洗1次PI避光,30min上机采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞周期分析G0/G1(2C)S(2C→4C)G2/M(4C)当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期的改变（异倍体）恶性肿瘤细胞增殖周期的判断：S10、G2/M15或S20、G2/M52、淋巴细胞亚群分析白细胞分化抗原（CD分子）的命名：1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群(ClusterofDifferentiation，CD)，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个分化抗体群被鉴定并命名流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个亚群。CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+T淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞B淋巴细胞（CD19+）NK细胞（CD16+56）+NK细胞:CD(16+56)+/CD3-B淋巴细胞:CD19+/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）50ul+10ul相应抗体避光孵育15min加OptiLyesC溶血素250ul室温10minPBS洗一次上机分析抗体:CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体CD19-PE/CD3-FITC二标抗体CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照淋巴细胞亚群检测临床意义：CD3+、CD4+、CD8+总数降低：细胞免疫功能低下CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血CD3+CD4+CD8+T细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。NK[CD(16+5