FRET

CFP,beforePBCFP,afterPBYFP,beforePBYFP,afterPBFRET荧光能量共振转移/FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)显微实验需要：1测量分子内/间相互作用显微镜最大光学分辨率≈200nm分子间/内相互作用距离10nm＝很难反映活细胞内的分子间相互作用关系及分子构象变化2活体离子浓度测量需要对细胞活动干扰小，对多种离子测量有效的指示剂荧光能量共振转移/FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)FRET:荧光共振能量转移。定义：FRET是指当两个荧光基团满足一定条件时发生的一种非辐射性的、偶极-偶极配对过程，借此过程，能量从激发态荧光供体以非常接近的波长转移到荧光受体。FRET产生条件1存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠常用的FRET组合：CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC；YFP-Cy32供体和受体的距离足够近：1-10nm（1－10nm为分子内/间互作的距离：如蛋白质构象转变、酶催化反应等。）3合适的偶极方向4足够的荧光寿命无FRETFRETFRET产生条件FRET观察方式供体荧光激发后可以观察到受体荧光无FRETFRETCFPYFPFRETFRET计算FRET应用1分子内结构变化（蛋白质、DNA构象等）2分子间相互作用（酶活力、离子通道结构变化等）3离子浓度测量（通过构建FRET蛋白测量Ca2+,PH,cAMP等）4分子间作用距离测量荧光的效率与距离成6次幂关系，可以灵敏测量1－10nm内的距离变化FRET的一种应用——测定Hela活细胞中的Ca2+浓度Cameleon(变色指示剂)一种合成蛋白，由4个部分组成：–CFP–钙调素（CaM）–缩氨酸（M13）–YFPCaM结合Ca2+后，蛋白构象发生变化，产生分子折叠，使CFP/YFP相互靠近,产生FRET.CFP荧光波长485nmYFP荧光波长530nm*胞内Ca2+浓度↑,FRET的效率↑485nm荧光减弱,530nm荧光增强.*CFP和YFP间的能量转移与相当的钙成比例.细胞内Ca2+浓度通过荧光比率法测定:Ratio=I530/I485FRET的一种应用——测定Hela活细胞中的Ca2+浓度细胞内Ca2+浓度在组氨酸的作用下增加，这种增加被抗组氨酸药物（Cyproheptadine）抑制。