miRNA研究方法-miRNA芯片法

miRNA研究方法—miRNA芯片miRNA简介小RNA是19~28nt的调控RNA分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)和小干涉RNA(shortinterferingRNA，siRNA)两类，其中的miRNAs成为继siRNAs之后新的研究热点之一，名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域(3-untranslatedregion，3UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。在miRNA公共数据库miRBase()中已经有1W多条来自不同物种的miRNA序列。MiRNA检测方法要了解miRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。因此，miRNA表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。常用的检测方法有：1.Northernblotting2.核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。3.RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平，其他基于PCR技术检测miRNA的方法有引物延伸法，就是在引物的5末端加一个特异标记，可以定量测定低丰度的RNA含量；原位杂交技术（CISH,FISH）可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。4.芯片(microarrays)技术是一种较快的研究miRNA表达的方法。这里我们主要以美国signosis的“人miRNA芯片检测试剂I”为例来介绍miRNA的芯片技术的原理。miRNA在三个方面与信使核糖核酸不同：(1)miRNAs是相当小的分子，丰度差异较大(2)成熟miRNAs与其前体pre-miRNA和primiRNA共存，只是长度不同(3)许多miRNAs序列非常接近，例如同源分子，只是一个或几个核苷酸不同。所以，常规芯片技术不能直接用于分析这些分子。一些miRNA芯片产品市面上也可买到，但是这些产品或者繁琐需预分离microRNA，或者缺乏分辨力不能区分同源之间的差异，或者对低丰度的miRNAs不够敏感。对每一个miRNA分子，有二条引物（oligo）来识别，每条引物只识别miRNA一半的序列。其中的一个引物中含有标示序列（Tag），另外一个引物含有T7启动子序列。只有序列完全匹配的时候，两条引物才能和miRNA杂交，形成RNA/DNA的杂合体。即使只有一个核苷酸不匹配都会造成杂交或者随后连接的失败。这也是T7-OLA技术产品可分辨同源miRNA的原因。为了增加分子的稳定性，该DNA/RNA杂合体被延伸了一段序列（加入的另一对寡核苷酸与上述引物在T7和Tag部位互补）。含有生物素（biotin，B）的短序列通过互补结合到其中的一条引物上。通过结合有亲和素(Streptavidin)的磁珠分离出杂合体。然后，两引物在T4连接酶的作用下，被连接成一个DNA片断。随后经过线性扩增（转录），含有生物素的UTP整合到RNA序列中。把转录好的RNA序列和预先准备好的含有不同miRNA序列的膜，进行杂交。最后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素进行反应，加入发光底物测定。signosis的此类miRNA芯片步骤简单、流畅，主要包括三步：(1)含有miRNA的样品与提供的引物混合，形成RNA/DNA(miRNA/oligo)的杂合体(2)选出杂合体，除去游离的寡核苷酸，在miRNA引导下两引物连接成一个DNA片断(3)通过T7转录，扩增连接的DNA片断。结果展示详细实验步骤可在signosis网站下载。