当进行工艺放大时,“细胞”都在谈论什么？

当进行工艺放大时，“细胞”都在谈论什么？关键词：P/V；Mixingtime；KLa；CO2stripping细胞培养的小试工艺确定后，如何保证规模扩大后细胞生长、产品产量及质量的稳定性是一个新的考验。简单的说，工艺放大主要是保证细胞所处的环境不变，那么工艺放大过程中“细胞”在意的主要有哪些参数？影响细胞环境的参数主要有：P/V、Mixingtime、KLa和CO2stripping。工艺放大时常会根据这些参数进行放大，但有时不仅依靠单一因素进行放大，还会将两个或多个因素结合起来进行放大。P/V单位体积功耗比（P/V，Power/Volume），一定程度表示混合程度，P/V值直接影响物料混合及传质。P/V分为平均P/V和最大P/V，平均P/V可以测定反应器的总输入功率，最大局部P/V表现最高比能量耗散速率。工艺放大时P/V可以单独使用，也可以与kLa、vvm一起使用。P/V计算公式如下：其中，Po：功率指数；𝞺：液体密度（kg/m3）；N：搅拌速率（s-1）；Di：搅拌桨直径（m）；V：培养体积。其中，Po通常由供应商提供。不同规模反应器参考参数（图表来源：A-MabCassStudy）Mixingtime表征体系达到均质所需的时间，通过体系中添加一种标记物（如，盐、染料、放射性材料等）时，测定其达到95%均质状态所需的时间，即为混合时2LStandardScale-DownModel2LProcessCharacterizationStudies500L1000L5000L15000L25000L(Future)AverageP/V(W/m3)2.82.8-30.213.628.227.42625.6MaxlocalP/V(W/m3)5.955.95-47.62560545252KLa(hr-1)108-17810102020Mixingtime(s)2013-4548.343628191CO2strippingtime11-51.51.742.12.3间。为使测量模型更适应于细胞培养环境，推荐使用NaOH作为标记物，测量过程中采用两个pH电极测两个不同点的pH值，pH安装及NaOH添加位置如下图。电极安装及NaOH添加位置（图表来源：Scale-UpAnalysisforaCHOCellCultureProcessinLarge-ScaleBioreactors）下面图A表示标记物NaOH添加后，通过pH（上面和下面的探头）的变化表示体系从均质变为非均质，再变为均质的过程。图B为混合时间的计算方法，t=(t1+t2)/2。一般情况下，反应器规模越大，混合时间越长；混合时间与通气策略没有关系，而是由搅拌速率决定的，但混合时间会影响体系中的DO和pH（规模较大时），进而影响细胞生长。（图表来源：Scale-UpAnalysisforaCHOCellCultureProcessinLarge-ScaleBioreactors）氧气传质系数（KLa）KLa，表征氧气从气相进入到液相的速率，影响kLa的因素有很多，如液相性能、气泡大小、体系几何结构和操作参数等。由于氧气在水中的低溶解度，氧气传质速率（OTR）一直是好氧微生物培养的重要参数。细胞培养过程中，氧气从气泡进入细胞分为两个过程：1）从气相进入液相；2）从液相进入细胞，可以用氧气传质速率（OTR）和氧气吸收速率（OUR）表示。氧气从气泡进入细胞的过程（图表来源：BioreactorScale-UpandOxygenTransferRateinMicrobialProcesses:AnOverview）由体系中氧气质量平衡可知：dCL/dt=OTR-OUR；CL为液相溶氧浓度。根据双膜理论和亨利定律，OTR=kLa(hCB-CL)，CB为气相氧浓度，kLa为氧气传质系数。则dCL/dt=kLa(hCB-CL)-OUR。测定kLa可以采用化学和物理方法。通过化学反应（亚硫酸钠法）可以测定OTR和kLa，测定的值一般比正常要高，因为化学反应的快速性。众多测定kLa的物理方法中，常见的为动态测定模型，而此时又分为两种情况：1）考虑OUR，模拟细胞培养过程，在活细胞存在的条件下，一定时间内停止泵入氧气，将OUR和OTR分隔开测定。第一阶段确定OUR，第二阶段根据OUR和DO再测定kLa；2）不考虑OUR，体系中没有活细胞，通往氮气降低溶氧，第一阶段省略，仅用测定第二阶段。物理法测定kLa（图表来源：AnImprovedDynamicMethodtoMeasurekLainBioreactors）CO2strippingCO2stripping，表示体系中移除CO2的能力，即维持体系中pCO2水平的能力。不同细胞系的最佳pCO2均不同，当体系中CO2累积增加导致pCO2升高时不仅对细胞生长和蛋白产生影响，而且还会影响蛋白的质量如糖基化水平等。vvm较低时（0.002），kLaCO2（CO2传质系数，测定方法与kLa类似）还不能达到kLa的15%，且随着反应器规模的扩大kLaCO2越低，即CO2stripping越低。体系中气体饱和度和气泡量直接影响CO2stripping，提高vvm及气泡停留时间可以加快移除，搅拌转速与CO2stripping关系不大。参考文献：1.A-MabCassStudy2.Scale-UpAnalysisforaCHOCellCultureProcessinLarge-ScaleBioreactors3.AnImprovedDynamicMethodtoMeasurekLainBioreactors4.BioreactorScale-UpandOxygenTransferRateinMicrobialProcesses:AnOverview5.Apracticalapproachinbioreactorscale-upandprocesstransferusingacombinationofconstantP/Vandvvmasthecriterion文章首发CPhi.CN制药在线