多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100毫升，（准备用的前1-2天配制）。贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。4．0.04N抗坏血酸溶液：用粗天平称取0.35克抗坏血酸溶解到蒸馏水中，用水稀释至100毫升，混匀。溶液只能用一天。5．5%的偏磷酸溶液：50克偏磷酸（经验式HPO3）溶解到蒸馏水中，稀释至1升后混匀，保存于磨口玻璃瓶中。6．0.5%可溶性淀粉。五、操作程序称1克新鲜的植物材料，加蒸馏水于瓷研钵中研细，转移到50毫升容量瓶，混匀。充分振荡勿使沉淀下沉，吸10毫升这种悬浮液，倒入250毫升三角瓶中。加入1毫升pH6.4的磷酸缓冲液，再加入5毫升0.4N的抗坏血酸溶液，混匀。加入5毫升0.2%的邻苯二酚溶液，同时开始计时并充分振荡。为使空气中的氧气不断进入溶液一直要均匀地振荡2分钟。经精确作用2分钟后，加入5毫升5%的偏磷酸溶液以停止反应。（整个实验都应在20℃进行。即反各种试剂样液都予先放到20℃环境中，做时也在20℃环境下做，加入偏磷酸量还可根据自己的模索而定）。加入1毫升0.5%的淀粉溶液，用0.01N碘酸钾溶液滴定坑坏血酸的剩余物，直至兰色不消失为止。同时进行对照滴定。为此吸取10毫升悬浮液注入另一只三角瓶中，加5毫升偏磷酸，再加入1毫升pH6.4磷酸缓冲液，5毫升0.4N抗坏血酸，再加淀粉液，也用0.01NKIO3溶液滴定。六、计算多酚氧化酶活性式中：A——多酚氧化酶活性（1克分析物质，20℃下，1min氧化抗坏血酸的微克分子数）；50——分析材料悬浮液的总体积；（ml）；n——分析材料的重量（g）；10——测定酶活性所取的悬浮液体积（ml）；2——反应时间（min）；a——用于滴定对照的0.01KIO3溶液体积（ml）；b——用于样品滴定的0.01NKIO3溶液体积（ml）；5——0.01N抗坏血酸溶液每ml换算为微克分子数抗坏血酸的系数（）。