Ames试验

鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验法Ames试验杨灿•概述•实验原理•应用•缺点目录•Ames试验，全称污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验。•它是一种利用微生物进行基因突变的体外致突变实验法。利用一种突变型微生物菌株与被检化学物质接触，如果该化学物具有致突变性，则可使突变性微生物发生回复突变，重新成为野生型微生物。•该法适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。是应用最广泛的检测基因突变的体外试验。实验原理•鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变成野生型微生物，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。据此来检定受试物是否具有致突变作用。•为使受试物在体外测试中受到同活体类似的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系统一并加入培养基中，进一步提高实验方法的灵敏度。•标准试验菌株（配套菌株）：有四种•TA98、TA97：检测移码突变•TA100：检测碱基置换突变•TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感•只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。•只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。Ames试验原理S9是什么•因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电子的终致突变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳动物的代谢酶，微量检测直接及间接诱变剂，在进行Ames试验时，应分别进行不加及加代谢活化系统的检测。而在生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化酶系，所以，在Ames试验中加入的代谢活化系统应主要是混合功能氧化酶系，一般是加入S9混合液。S9即经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆，经9000r/min离心得到的上清液。在S9中再加入一些辅助因子，如辅酶Ⅱ（NADP+）、葡萄糖-6-磷酸，K+、Mg2+及缓冲液等组成S9混合液（S9mix）•不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。•加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。•突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以在Ames试验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验，否则应重新挑选菌种。•Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入法。•例如：用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等。应用•通过采用Ames试验，珠江流域的8个主要取水点的水源水和对应自来水中的有机致突变物污染情况进行研究。我们发现该试验是一个有效测定水环境污染物致突变性的初筛系统，可推测其潜在致癌的可能性,准确率相当高。它能反映水体中多种物质联合作用的效应，比分开测定水中单一化合物更具有实际意义。但该试验也还存在一些不足，如有10%的假阳性结果；试验方法简便，但影响因素多，重现性不理想；细菌试验和动物致癌性试验有很好的定性相关，但难以确定其定量相关；该试验为体外实验，对水质的评价尚需流行病学调查作为依据。•不足之处•微生物的遗传信息仅为哺乳动物的1/6；•微生物的DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧；•微生物无免疫功能，而哺乳动物则具有复杂的免疫监视机能。•少数不在肝脏中进行代谢转化的外来化合物，本法不能检出其突变性，如苏铁素。