QIA39 TUNEL荧光法凋亡检测试剂盒中文使用说明书_Merck

默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线：：：：400-820-8872邮箱邮箱邮箱邮箱：：：：[e-mail]1Calbiochem®FragEL™DNAFragmentationDetectionKit,Fluorescent-TdTEnzyme目录货号目录货号目录货号目录货号QIA39背景介绍背景介绍背景介绍背景介绍：：：：细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中发挥着重要的作用。细胞凋亡发生在正常的细胞周期循环中，并发生形态学和生理生化的特征性改变，比如细胞皱缩，细胞间连接消失，线粒体膜电位消失，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp的片段；胞膜有小泡状突起，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍保持完整，最终凋亡细胞遗骸被分割包裹为几个凋亡小体，并迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。以上改变发生在不同的细胞凋亡阶段。检测原理检测原理检测原理检测原理：：：：在凋亡晚期细胞中，DNA会被降解为不同大小的片段，正常的或正在增殖的细胞则几乎没有DNA的断裂，该方法是将荧光素（Fluorescein）标记和未标记的dNTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT酶）的作用下，连接到凋亡细胞中断裂DNA片段的3’-OH末端，然后进行荧光显微镜或流式细胞仪检测。试剂盒对标记反应进行了优化试剂盒对标记反应进行了优化试剂盒对标记反应进行了优化试剂盒对标记反应进行了优化，，，，采用最佳比例的荧光素标记和未标记的采用最佳比例的荧光素标记和未标记的采用最佳比例的荧光素标记和未标记的采用最佳比例的荧光素标记和未标记的dNTP进进进进行行行行3’-OH末端的核苷酸掺入末端的核苷酸掺入末端的核苷酸掺入末端的核苷酸掺入，，，，使得同一个断裂的使得同一个断裂的使得同一个断裂的使得同一个断裂的DNA片段片段片段片段末端可以形成更长的末端可以形成更长的末端可以形成更长的末端可以形成更长的““““标记尾巴标记尾巴标记尾巴标记尾巴””””，，，，该该该该““““标记尾巴标记尾巴标记尾巴标记尾巴””””减少了相邻掺入减少了相邻掺入减少了相邻掺入减少了相邻掺入dNTP上标记基团的空间位阻上标记基团的空间位阻上标记基团的空间位阻上标记基团的空间位阻，，，，增加每个断裂片段后的荧光基团数目增加每个断裂片段后的荧光基团数目增加每个断裂片段后的荧光基团数目增加每个断裂片段后的荧光基团数目，，，，降低荧光基团相邻后可能造成的降低荧光基团相邻后可能造成的降低荧光基团相邻后可能造成的降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭聚集和淬灭聚集和淬灭聚集和淬灭，，，，从而提高检测灵敏度从而提高检测灵敏度从而提高检测灵敏度从而提高检测灵敏度，，，，减少非特异性反应减少非特异性反应减少非特异性反应减少非特异性反应。。。。此外试剂盒提供的封片剂中含有DAPI核染料，可以将全部标记和未标记细胞的DNA着色，并在330-380nm波长激发光下发出荧光，从而得以判断凋亡细胞占总细胞比例。封片剂还可以稳定和增强荧光信号，减少淬灭，从而提高检测的灵敏度。检测次数检测次数检测次数检测次数：：：：50次检测方法检测方法检测方法检测方法：：：：荧光显微镜或流式细胞仪样本类型样本类型样本类型样本类型：：：：石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及细胞悬液种属反应种属反应种属反应种属反应：：：：一一一一系列不同种属储存与运输条件储存与运输条件储存与运输条件储存与运输条件：：：：试剂盒需用干冰运输并储存在-20℃非无霜冰箱中默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线：：：：400-820-8872邮箱邮箱邮箱邮箱：：：：[e-mail]2图1.试剂盒检测原理图试剂盒组分试剂盒组分试剂盒组分试剂盒组分：：：：（1）蛋白酶K（PROTEINASEK）：用来消化细胞，增加样本的通透性。（2）5×TdT平衡缓冲液（5XTdTEQUILIBRATIONBUFFER）：使用前需稀释5倍。（3）荧光素片段末端标记反应混合物（FLUORESCEIN-FragELTMLABELINGREACTIONMIX）：带标签和不带标签的脱氧核糖核苷酸以最佳的比例混合，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT酶）的作用下标记DNA片段末端。（4）MOUNTINGMEDIA：水性封片剂，含DAPI核染料。用于维持和增强荧光信号，并通过染色所有细胞的细胞核DNA从而观察样本中的全体细胞。（5）HL-60细胞阳性/阴性对照片：提供两张已经固定的细胞甩片，一张是用0.5μg/ml放线菌素D处理19小时的HL-60细胞，另一张则是未诱导的HL-60细胞，分别作为凋亡阳性和阴性对照。（6）TdT酶（TdTENZYME）：将标记和未标记的脱氧核糖核苷酸掺入断裂的DNA3’-OH末端。注意：TdT酶在-20℃保存时不会凝固，因此不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存。注意：其他组分也在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用。默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线：：：：400-820-8872邮箱邮箱邮箱邮箱：：：：[e-mail]3实验准备实验准备实验准备实验准备：：：：实验需用到的仪器耗材有：荧光显微镜、小型染色缸、湿盒（塑料/玻璃容器与吸水纸）、冰盒、洗瓶、盖玻片、封口膜、各种规格的移液器及枪头等。除试剂盒提供的组分外，需自备的实验试剂有：二甲苯、梯度稀释乙醇溶液（100%、90%、80%、70%）、10mMTris溶液（pH8.0）、TBS缓冲液、DNA酶Ⅰ、MgSO4等。注意事项注意事项注意事项注意事项：：：：为了获得最佳的实验结果，请在操作前认真阅读以下注意事项。（1）TdT酶在-20℃保存时不会凝固，因此不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回保存；其他组分除封片剂外，在使用时也需放置在冰上，并在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用。避免不必要的反复冻融。（2）由于封片剂中含致癌、致畸物质，并可能伤害皮肤和眼睛，因此在封片操作前必须穿戴好手套、实验服和护目镜。不要吞咽。（3）针对不同的样本类型，比如石蜡包埋组织切片，组织冰冻切片、固定细胞片以及细胞悬液等，各有不同的操作流程，请根据实验的样本类型参考相应的操作流程。阳性/阴性对照的HL-60细胞片需按照固定细胞片的操作流程操作。（4）蛋白酶K孵育时间，DNaseI处理时间及标记反应时间需根据细胞类型，样本制备步骤摸索摸索摸索摸索最适条件最适条件最适条件最适条件。以说明书中的条件为初始参考标准。（5）在标记反应中，推荐使用盖片或封口膜覆盖样本，保证反应液均匀分布，并避免孵育过程中缓冲液蒸发损失。准备覆盖膜时，可剪下一片Parafilm®封口膜，使其稍大于样本，并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放。（6）用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒，在样本处理过程中使用湿盒保持样本存放环境的湿润，一定一定一定一定避免样本干燥避免样本干燥避免样本干燥避免样本干燥。（7）悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上：4°C缓慢离心（1000rpm）5分钟，去除细胞培养上清，并将细胞重新悬浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS溶液）使其终密度为1×106/ml，室温孵育10分钟。按照上述方法离心收集细胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细胞可以保存在4°C。固定后的细胞（100-300μl）可直接固定在玻片上或用Cytospin®辅助制备细胞片。使用聚L-赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性。操作流程操作流程操作流程操作流程：：：：一一一一石蜡包埋组织切片处理流程石蜡包埋组织切片处理流程石蜡包埋组织切片处理流程石蜡包埋组织切片处理流程A.样本的样本的样本的样本的脱蜡脱蜡脱蜡脱蜡处理处理处理处理1、室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡。2、室温下用100%乙醇浸泡切片5分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5分钟。3、室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3分钟，逐渐增加水分。4、用1×TBS轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔（Cat.#402176）在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。B.增加样本的通透性增加样本的通透性增加样本的通透性增加样本的通透性1、按1：100的比例，用10mMTris溶液（pH8.0）作为稀释液来稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为20μg/ml。每个样本需要100μL蛋白酶K溶液（可以将1μL的2mg/ml蛋白酶K溶液加至99μL的10mMTris溶液中配制而成）。默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线默克生命科学服务热线：：：：400-820-8872邮箱邮箱邮箱邮箱：：：：[e-mail]42、每个样本上滴加100μL浓度为20μg/ml的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20分钟。注意严注意严注意严注意严格控制孵育时间格控制孵育时间格控制孵育时间格控制孵育时间，，，，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害，，，，过短则可能造成透性处理不过短则可能造成透性处理不过短则可能造成透性处理不过短则可能造成透性处理不充充充充分分分分，，，，影响标记效率影响标记效率影响标记效率影响标记效率。。。。蛋白酶K工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件。3、用1×TBS溶液润洗样本。4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。C.样本阳性对照处理样本阳性对照处理样本阳性对照处理样本阳性对照处理样本阳性对照实验为选做，可根据自身情况分析选做。但试剂盒提供的HL-60细胞的阳性/阴性对照片建议操作。1、取经过预处理（已完成通透性处理）的组织包埋切片，用含有1μg/μl的DNA酶Ⅰ（Cat.#69164）溶液（含有1mMMgSO4的1×TBS溶液）完全覆盖样本，室温孵育20分钟。2、用1×TBS溶液润洗玻片。3、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。4、样本阴性对照和试剂盒提供的未诱导凋亡HL-60细胞片对照为建议必做实验，其处理方法与样本的处理方法相同，但在平衡和标记反应加入TdT酶步骤时用蒸馏水替代TdT酶。D.平衡和标记反应平衡和标记反应平衡和标记反应平衡和标记反应1、按1：5的比例用蒸馏水稀释5×TdT平衡缓冲液（每个样本需用20μl5×缓冲液和80μl蒸馏水混合稀释成100μl缓冲液）。2、滴加100μl1×TdT平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×TdT平衡缓冲液的缸中，保证缓冲液没过样本。在等待孵育的同时准备标记反应混合物。3、把TdT酶从冰箱中取出，为了减少试剂损耗，在打开管盖前需短暂离心试管。将置于冰上的洁净离心管一一做好标记，用移液器准确加入57μl荧光素片段末端标记反应混合物（FLUORESCEIN-FragELTMLABELINGREACTIONMIX）和3μlTdT酶（TdTENZYME），轻轻吹打混匀备用。阴性对照的标记反应混合物中不加TdT酶，而用蒸馏水替代。4、轻轻吸