7细胞凋亡分子机制及检测107页PPT

细胞凋亡分子机制及检测细胞发生代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡。细胞死亡包括坏死和凋亡两大类型。相比起细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式。在20世纪70年代，科学家们发现了细胞凋亡，这一研究成果获得了2019年诺贝尔生理/医学奖。有丝分裂细胞增多动态平衡细胞凋亡细胞减少新生细胞出现，产生相应功能机体正常生原有的、不必要的、有害的细胞除去长发育细胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。特征:即散在地、逐个地从正常组织中死亡和消失,机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。凋亡概念的形成1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞。这些细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段（1972-1987）1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。2）染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。3）RNA/蛋白质大分子的合成。4）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。5）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。细胞凋亡的分子生物学研究阶段1）细胞凋亡相关基因及其调控2）细胞凋亡的信号转导3）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系4)细胞凋亡的临床应用基础研究阶段细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。细胞的生长发育、增殖、分化和死亡是细胞的4大特点，细胞死亡分为细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡(apoptosis)是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程,是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。第一节概述一、细胞凋亡概念和特征细胞坏死（necrosis）是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的病理性死亡。其特点是:引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。表现为能量代谢下降—膜通透性增加—细胞水肿—细胞器破裂，细胞溶解，DNA不断裂—内含物释放—引起炎症反应。细胞凋亡:细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解—细胞和细胞器浓缩而不裂解—染色体DNA断裂和形成凋亡小体—细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。细胞凋亡Apoptosis和细胞坏死Necrosis细胞凋亡的形态学特征•细胞：首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩，细胞膜结构仍保持完整。•细胞核的变化：胞核内染色质浓缩形成密集颗粒，位于核被膜下。•细胞器：线粒体：保持完整呈正常状态溶酶体：保持完整，内容物不外泄形成凋亡小体：内质网、高尔基复合体及核被膜膨大,形成泡状结构与细胞膜融合，以出泡方式离开正在死亡的细胞，将所包含的完整细胞器和核碎片等细胞内容物以细胞质膜包被成凋亡小体(apoptosisbodies）释放到细胞外。凋亡小体很快被周围邻近间质细胞或巨噬细胞吞噬，而不引起周围组织的炎症反应。胸腺细胞正常凋亡生物化学方面：核酸内切酶活化与DNA电泳呈梯子状改变是apoptosis的生物化学标志。核酸内切酶在核小体连接处将DNA链切断，从而最终产生寡聚核小体。这些寡聚核小体的大小均是DNA长度为180-200个碱基对(bp)的倍数，因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA时出现特征性的“梯状”（ladder）带纹。LadderPatternofApoptoticCells二、细胞凋亡的生理意义1.维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡：清除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。2.在胚胎发育中起重要作用a手指和脚趾的形成等。b大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。c在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。d心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。3.细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。未成熟B细胞（immatureBcell）完成骨髓发育阶段后，进入血液循环。尽管它表达膜表面抗原受体，但不具备免疫活性。因此，在结合抗原后，细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。只有经过不同阶段的过渡期，分化为成熟B细胞，才具有免疫活性。过渡期B细胞的发育、成熟是受复杂的调控。一方面，细胞的生存机制促进未成熟B细胞的存活与发育，保证了B细胞成熟的顺利完成。另一方面，70%的细胞凋亡，消除潜在自身反应性B细胞，实现了对自身组织的免疫耐受。由HIV感染引起的艾滋病有一个重要特征是随着病情的发展，CD4T细胞数进行性减少，其主要原因是：1，HIV感染细胞后产生一些调控性基因产物，这些产物使未被感染细胞对CD95介导的凋亡高度敏感（即通过Fas-FasL应答而使未被感染的细胞凋亡）；2，被HIV感染的CD4T细胞大量复制子病毒，导致细胞死亡，同时又使更多的细胞被感染。随感染时间的延长造成免疫系统进行性损伤和崩溃。由此可见:HIV即可引起细胞凋亡也可引起细胞坏死.一、半胱天冬酶（胱冬酶，caspase，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，cysteine-containingaspartate-specificprotease)第二节细胞凋亡相关基因和蛋白质Caspase的含义表现在两个方面（１）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团；（２）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。•Asp特异性半胱氨酸蛋白酶.caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解一种蛋白质。•是一类促进细胞凋亡的蛋白水解酶，在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞凋亡。1Caspase的结构和功能•Caspase共有十多种，结构相似，都以酶原的形式分泌。酶原水解激活后产生前结构域，大亚基和小亚基三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。•N端结构域——参与酶功能激活调节;•大、小亚基——提供与底物结合及催化所需的氨基酸。Caspase可专一、高效地特异性水解一系列蛋白质底物,并导致蛋白质功能丧失或改变。•caspase酶原••前结构域+大亚基+小亚基•大•异二聚体•小•大大•异四聚体活性形式•小小活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为６个α螺旋环绕的6个β片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。CrystalStructuresofHumanCaspasesStructureofCaspase-7withInhibitorCaspase作用：是一类蛋白水解酶，可特异水解底物蛋白分子中天冬氨酸残基羧基侧的肽键，从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。N····A-B-C-D-X····C不同的Caspase对ABCD种类要求不同。Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。其中caspase3的作用最重要。但并非所有的凋亡过程都有caspase的参与。2Caspase的分类（1）上游/启动型caspase:2、8、9、10，12处于细胞凋亡信号传递途径的上游，在凋亡信号的刺激下首先被激活，然后再水解激活下游的caspase.（2）下游/执行型caspase:3、6、7处于细胞凋亡信后传递途径的下游，被上游caspase激活后直接水解与细胞凋亡有关的底物蛋白，引起细胞形态学和生物化学改变以及DNA的断裂。3Caspase的底物1、细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白。2、与DNA损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复。如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制相关蛋白。3、激活DNA酶，促进DNA断裂。二、死亡受体及相关蛋白是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：*死亡配体（细胞外）→死亡受体（细胞膜）→相关蛋白（中介蛋白，细胞内）→激活caspase→诱导细胞凋亡1死亡受体(deathreceptor,DR)死亡受体——是一类跨膜蛋白，与其配体结合后可把凋亡信号传递到细胞内部。主要的死亡受体是TNF-R超家族；配体死亡受体TNF-αTNF-R1FasLFas（CD95/APO-1）APO-3LDR-3（WOL-1）APO-2DR-4（TRAIL-R1）TRAILDR-5（TRAIL-R2）（TNF相关的凋亡诱导配体，TNF-relatedapoptosis-inducingligand）DeathDomain-细胞凋亡Fas–associatedproteinwithdeathdomainTNFreceptor-1–associateddeathdomainproteinApoptosiscaspase激活的DNA酶（caspase—activateddeoxyribonuclease，CAD）ICAD（inhibitorofCAD）2死亡受体相关蛋白（中介蛋白/接头蛋白）是连接死亡受体和caspase的中介蛋白，把凋亡信号从死亡受体传递给caspase。(1)FADD（Fas相关的死亡结构域蛋白，Fasassociateddeathdomainprotein)由两部分构成,介导Fas和TNFR－1两种受体的细胞凋亡信号:A死亡结构域：与Fas的DD相互作用B死亡效应区：与启动型caspase2、8、9、10作用(2)TRADD（TNFR-1相关死亡结构域蛋白）从TNFR-1接受死亡信号，然后传递给FADD.ThisproteincanalsointeractwithreceptorFAS,andisinvolvedintheFas-inducedcelldeathpathway三、凋亡蛋白酶激活因子类（apoptosisproteaseactivationfactor,Apaf）•一类促进细胞凋亡的蛋白因子，参与细胞凋亡的线粒体信息传递途经。•细胞凋亡与线粒体膜电位及通透性改变有关。凡是诱导细胞凋亡的因素，都可使线粒体的膜电位下降，膜通透性增加，线粒体膜通透性转运孔（MPT）开放，释放出多种可激活caspase的蛋白因子，包括细胞色素c(Cytc)，凋亡诱导因子(AIF)。1细胞色素c（Cytc）•细胞色素c是呼吸链的重要成员，是由线粒体DNA编码的蛋白质。•细胞凋亡信号→线粒体膜通透性增加，Cytc释放到胞浆→与Apaf-1和caspase-9结合成复合体，诱导凋亡。2凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptoticproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1）在正常情况下Apaf-1以无活性的单体存在于细胞质，在凋亡信号的作用下，其N-端与Caspase-9结合，其C端与细胞色素C结合。形成Cytc-Apaf-1-Caspase-9复合体---凋亡酶体（apoptosome)。首先激活