1细胞凋亡及检测技术

细胞凋亡及检测技术概述细胞凋亡过程细胞凋亡的调控细胞凋亡与疾病细胞凋亡的检测悉尼·布雷诺尔罗伯特·霍维茨约翰·苏尔斯顿2002年诺贝尔生理与医学奖获得者•概述一、细胞死亡的模式■Necrosis=细胞病理性死亡■Apoptosis=细胞自发性死亡坏死凋亡Conceptofapoptosis:体内外生理或病理因素触发细胞内死亡程序→细胞死亡细胞坏死与细胞凋亡的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激受累范围单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减小、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿张破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理死亡方式病理死亡方式凋亡的生理学意义:■胚胎发育期去除某些细胞■维持内环境稳定增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞■参与防御反应细胞毒T细胞凋亡过多或不足→→疾病：肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤二、凋亡时细胞的主要变化1.形态学改变（Themorphologiccharacteristicsofapoptosis）•凋亡细胞（实体细胞）与周围细胞脱接触•胞膜空泡化（Blebbing）•细胞固缩（Condensation）、核固缩和发芽•凋亡小体（Apoptoticsmallbody）(扫描电镜)正常细胞(扫描电镜)(透射电镜)凋亡细胞—凋亡小体DNA片断化caspase激活灭活凋亡抑制物水解活性蛋白水解结构蛋白Ca2+/Mg2+Zn2+核酸内切酶激活①②③2.生化改变（Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis）钙超载■DNA片段化（DNAladdingpattern）核酸内切酶激活核小体连接区DNA降解180～200bp整数倍的DNA片段■细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻•细胞凋亡过程cAMPCa2+神经酰胺凋亡诱因凋亡信号转导凋亡基因激活细胞凋亡凋亡细胞清除受体死亡信号DNase活化Caspases活化↓∶DNA片断↓凋亡小体形成巨噬细胞吞噬、分解•细胞凋亡的调控㈠细胞凋亡相关因素诱导性因素激素和生长因子失衡理化因素免疫性因素微生物学因素大量糖皮质激素↓淋巴细胞凋亡射线/高温/强酸/强碱/乙醇/抗癌药物CTL分泌粒酶HIV→CD4+细胞凋亡抑制性因素细胞因子(IL-2/NGF)激素(ACTH/睾丸酮/雌激素)金属阳离子(Zn2+)药物(苯巴比妥/半胱氨酸酶抑制剂)病毒EB病毒/牛痘病毒（二）细胞凋亡信号的转导细胞凋亡的两条通路：死亡受体途径、线粒体途径（1）死亡受体途径（deathreceptorpathway）死亡受体（deathreceptor,DR）肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋白，与相应配体结合传递细胞信号Fas(CD95),TNFR1,RAIL-R2/DR5参与死亡受体信号转导的接头蛋白：死亡结构域蛋白（deathdomainprotein,DD）TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF+TNFR1（死亡结构域）+TRADD→→细胞凋亡FADD：Fas相关死亡结构域蛋白FasL+Fas（死亡结构域）+FADD→→细胞凋亡FasL+Fas凋亡诱导复合物（DISC）FADD（C端DD结构域与Fas胞内段结合N端DED结构域与无活性caspase8酶原交联）caspase8酶原聚集到复合物上一系列caspase激活细胞凋亡FADD（Fas-associateddeathdomain）DD（deathdomain）DED（deatheffectordomain）FSALFADDPro-caspase-8Caspase-8Caspase-3Pro-caspase-3细胞凋亡FasDEDDEDDD（2）线粒体途径线粒体释放细胞色素C→→细胞凋亡PT孔开放→线粒体跨膜电位↓，细胞色素C释放促凋亡蛋白Bax促PT孔开放抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔开放细胞色素C+Apaf-1+caspase9前体—凋亡小体召集并激活caspase3→→细胞凋亡Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子膜通透性↑、线粒体肿胀、△m↓Apaf-1活化Cyt.c线粒体途径（mitochondrialpathway）Ca2+NO缺氧活性氧应激PT开放Cyt.c+Pro-caspase-9Caspase-9ATPApaf-1+Apaf-1活化Cyt.cCARDApoptosomeAIFcaspase-independentapoptosisPro-Caspase-3凋亡Caspase-3BidCaspase-8Caspase特点：(Cysteine，asparticacid，protease)--以酶原的形式存在--受激活后内部的天冬氨酸残基水解形成大、小亚基，聚集成四聚体而活化Caspase依赖的细胞凋亡Caspase家族的分类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase9，Caspase10凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7ICE(interlukin-1βconvertingenzyme)亚类Caspase蛋白酶：参与炎症反应Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11,Caspase12，Caspase13，Caspase14■Caspase通路分类启动亚类（Caspase-8,-9,-10）效应亚类（Caspase-3,-6,-7）▲Caspase死亡受体途径线粒体途径大小亚基结合（二聚体）caspase激活（四聚体）■Caspase激活形式Pro-caspase：NH2末端结构域、20KD亚基、10KD亚基剪切Caspase可激活CAD(caspase-activatedDNase)核酸酶，该酶在核小体的连接区将DNA切断，形成约200bp整倍数的核酸片段正常情况下，CAD与抑制物ICAD-DFF-45结合，存在于胞质中，无活性Caspase活化后降解抑制物ICAD，CAD激活并入核降解DNA使其片段化Pro-caspase-2caspase-2Pro-caspase-6Caspase-6Pro-caspase-7caspase-7Pro-caspase-9ICAD（抑制性CAD）被水解CAD（caspase活化DNA酶）活化CDA进入细胞核内降解DNA细胞凋亡剪切细胞内结构蛋白caspase-9EffectorcaspaseCaspase-3Pro-caspase-3Caspase非依赖的细胞凋亡（Caspase-independentapoptosis）■凋亡诱导因子（AIF）线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因子结合，从而促发凋亡■钙超载钙超载引起凋亡机制胞浆[Ca2+]↑■激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录■激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链■激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架分解→凋亡小体细胞凋亡（三）、细胞凋亡的调控基因（Regulatedmechanismofapoptosis）表1细胞凋亡的调控基因功能基因抑制凋亡基因Bcl-2Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等促凋亡基因P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等双向调控基因c-myc、BelxBcl-2基因（Bcelllymphoma/leukemia-2）广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞Bcl-2家族已发现15个成员，可分为3个亚族：Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡Bax亚家族：促进细胞凋亡BH3亚家族：促进细胞凋亡Bcl-2抑制凋亡机制：■抑制线粒体PT孔开放，Cyt.c、AIF释放↓■结合和灭活Apaf-1，阻断caspase-9活化■特异性结合细胞色素C■维持细胞钙稳态p53促凋亡机制：--与Bcl-2基因相互作用，下调Bcl-2的表达--诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（Bax等）表达，并触发细胞色素C释放和caspase活化--诱导死亡受体Fas表达C-myc双向调控凋亡调控细胞周期基因，编码的蛋白是DNA结合蛋白，调控基因转录。•GF充足时主要激活介导细胞增殖的基因•GF不足时激活凋亡基因•凋亡与疾病（Diseasesassociatedtoapoptosis）表：与细胞凋亡异常相关的疾病凋亡不足凋亡过度肿瘤肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌发育异常气管-食管瘘、房（室）间隙缺、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前损、唇（腭）裂、短肢畸形、列腺癌等尿道下裂以及多囊肾等发育异常先天性消化道、胆道、肛门狭CNSAlzheimer病、Parkinson病、窄或闭锁、动脉导管未闭、两肌萎缩性侧索硬化症、色素性性畸形、甲状舌骨囊肿等视网膜病，脊肌肉萎缩、早老免疫系统系统性红斑狼疮、糖尿病、类性痴呆风湿性关节炎、桥本甲状腺炎免疫系统免疫缺陷病、AIDS、多发性的硬化症等（一）细胞凋亡不足（Apoptosisinhibition）1.肿瘤（Tumor）■bcl-2基因过表达85%滤泡状和20%弥漫性B细胞淋巴瘤染色体t（14;18）易位IgH基因与bcl-2基因拼接bcl-2基因活化细胞凋亡速率↓肿瘤发生（乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl-2高表达）■p53基因缺失或突变p53的稳定性、细胞内定位或（和）活性异常p53表达或功能缺陷细胞凋亡率↓肿瘤发生■病毒的癌基因HBV编码的HBX是Caspase-3的强效抑制物，与肝癌发生密切相关■异常融合蛋白慢性髓细胞性白血病（CML）染色体易位t(9；22)Bcr-abl融合基因（p210Bcr-abl蛋白质）NF-B活化、细胞凋亡速率↓髓系祖细胞的克隆扩增肿瘤发生2．自身免疫病（Autoimmunediseases）针对自身抗原的免疫细胞未被及时清除，机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫，导致器官组织损伤。（二）细胞凋亡过度（Apoptosisexcess）1.心肌缺血与缺血-再灌注损伤■特点▲缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞坏死为主。▲在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主；▲轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主；■机制▲氧化应激▲Fas通路▲p53基因转录增加2.心力衰竭氧化应激压力、容量负荷↑神经-内分泌失调TNF缺血、缺氧→心肌细胞凋亡3.神经元退行性疾病--阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)β-淀粉样蛋白/钙超载/氧化应激/NGF↓→神经元凋亡--帕金森氏症(Parkinson’sdisease)--多发性硬化症3.病毒感染AIDS细胞凋亡过度•Gp120糖蛋白-CD4结合→CD4+细胞凋亡•Fas基因表达↑•HIV-感染→CD4+细胞→合胞体形成•T细胞激活→AICD•巨噬细胞→TNF分泌↑•HIV-感染→tat蛋白表达→CD4+细胞产生氧自由基三、细胞凋亡不足与过度并存动脉粥样硬化氧化型LDL↑血小板激活AgⅡ高血压内皮细胞凋亡↑平滑肌细胞增殖平滑肌细胞凋亡细胞凋亡在疾病防治中的意义㈠合理利用凋亡相关因素1.诱导靶细胞凋亡放疗、化疗高热、高温2.减少细胞凋亡：NGF、促生长因子、抗氧化剂抑制Bcl-2抗凋亡作用促进促凋亡基因作用增强P53促凋亡作用㈡干预凋亡信号转导㈢调节凋亡相关基因㈣控制凋亡相关酶学机制㈤防止线粒体跨膜电位的下降•细胞凋亡的检测1、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测2、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）3、线粒体膜势能（mt）的检测4、DNA片断化检测5、TUNEL法6、Caspase-3活性的检测7、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析1、细胞凋亡的形态学检测•光学显微镜和倒置显微镜•未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出