第十二章--其他分子诊断检测技术

第十二章其他分子诊断检测技术临床生物化学教研室付祖姣博士目录第一节基因变异检测技术第二节脉冲电场凝胶电泳第三节分子影像第一节基因变异检测技术1.检测已知的基因突变2.检测未知的基因突变分子诊断检测基因突变的目的：几种常见的基因变异检测方法一．PCR扩增阻碍突变系统二．寡核苷酸连接实验三．温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳四．变性高效液相色谱法五．错配接合蛋白质截短测试法一、PCR扩增阻碍突变系统(PCRamplificationregractorymytationsystem,PCR-ARMS)以PCR方法为基础，检测已知点突变的一种方法。又叫做PCR等位基因特异性扩增法（PCRamplificationofspecificalleles,PASA）或等位基因特异性PCR(alleles-specificPCR,ASPCR)（一）基本原理PCR的引物3’末端的核苷酸与模板之间存在错配时，PCR扩增效果差，或者不能扩增。模板3’5’引物5’3’×ATGTTATACAACPCR-ARMS设计2对引物，一对引物（P1）与正常基因完全匹配，一对引物(P2)与突变基因完全匹配。用这两对引物分别扩增模板。如果模板基因为正常基因，那么P1扩增可以得到大量产物，而P2无产物。如果模板已经突变，那么P2扩增可以获得大量产物，而P1无产物。PCR-ARMS基本原理PCR-ARMS5’3’3’5’ATGGTTCCTGTACCAAGGAC5’3’3’5’ATGGTACCTGTACCATGGAC突变等位基因正常等位基因顺利延长不能延长5’3’ATCGTT5’3’ATCGTT×突变基因的引物P2的扩增PCR-ARMS（二）应用1.检测单一点突变2.基因分型3.检测多位点突变PCR-ARMS的应用1.检测单一点突变设计一对引物，可以扩增突变基因而对正常基因呈扩增阻遏；附加一对引物，可以扩增标志性基因作为阳性对照；PCR扩增完成，进行电泳，即可得知点突变是否发生。MMGNG异常阳性对照突变基因PCR-ARMS的应用2.基因分型可用于单个突变的基因分型（鉴别杂合子和纯合子）或多态性分析PCR-ARMS的应用1:正常基因的引物扩增结果；2：突变基因的引物扩增结果MWt1Wt2Ht1Ht2Hm1Hm2野生纯合子杂合子突变纯合子方法一：正常等位基因野生纯合子点突变突变杂合子稳定遗传突变纯合子方法二：野生纯合子杂合子突变纯合子MWtHtHm5’3’3’5’496bp371bp野生型基因引物突变型基因引物突变点PCR-ARMS的应用3.检测多位点突变突变点1突变点2片段1片段2PCR-ARMS的应用PCR-ARMS可同时检测多个点突变。（三）方法学评价适用于较少点突变的检测；具有低-中等批量处理能力；可借助多重PCR检测多个点突变；无需放射性标记；无需昂贵的试剂；无需复杂的检测系统PCR-ARMS优点缺点只能检测已知的基因突变及多态性二、寡核苷酸连接实验(oligonucleotideligationassay,OLA)利用DNA连接酶，将2段寡核苷酸探针顺向连接，从而检测靶基因型的一种方法。该方法因为可靠、精确、重现性好，已成为临床遗传病分子诊断的一种基本方法。（一）基本原理嗜温性或耐热的连接酶具有高特异性和高保真性，它能连接与模板序列完全互补的两段核苷酸片段。OLA的基本原理DNA连接酶5’3’TACCAAGGACGATTCCTGATCATGGTTCCTGCTAAGGACTAG3’5’5’3’TACCAAGGACGATTCCTGATCATGGTTCCTACTAAGGACTAG3’5’×双等位基因变异的检测OLA的基本原理探针15’等位基因A3’TACCAAGGACGATTCCTGATCATGGTTCCTGCTAAGGACTAG3’5’TACCAAGGAGGATTCCTGATCATGGTTCCTCCTAAGGACTAG3’5’探针25’等位基因a3’通用探针OLA实验的操作耐热连接酶，可使变性和连接连续进行，产物呈线性增长，大大增加了检测的灵敏度；若PCR扩增引物的Tm值大于探针的Tm值，可在同一管内先进行PCR，再进行OLA实验，大大减少了污染，提高检测效率。2.条件：1.反应体系：3.方法的发展：2个探针、DNA连接酶、模板探针与靶序列的杂交区域足够长（20bp）温度：能使探针和靶序列杂交OLA的基本原理（二）临床应用1.镰状细胞贫血症的分子诊断、产前检查2.多种遗传病及常见病的检测(P168)；3.局部地区人群的遗传病分子检测PCR-OLA的应用（三）方法学评价能可靠地鉴别基因型及纯、杂合子；不容易产生假阴性和假阳性结果；利用耐热连接酶循环进行连接，使信号放大，更增强了该法的灵敏度优点：缺点：需要多相参与，增加实验的复杂度；需要PCR扩增与OLA相结合，PCR的非特异性扩增导致了该方法的重现性不够PCR-OLA的方法学评价三、温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳利用不同的分子在不同浓度的变性剂作用下，失活而改变分子构象，进而进行分离的一种电泳技术。利用不同的分子在不同的温度下，构象改变的不同而进行分离的一种电泳技术。温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE）变性梯度凝胶电泳(denaturing-gradientgelelectrophoresis,DGGE)46℃50℃54℃58℃62℃－＋（一）TGGE的基本原理普通的非变性凝胶电泳不能分离具有相似长度的DNA，所以也不能分离发生了单核苷酸突变的DNA序列。但是在温度梯度凝胶电泳中，随着温度的逐渐升高，DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA分子表现出一种复杂的分枝构象，使得其电泳迁移率大大下降。TGGETGGE的基本原理TGGE5’3’3’5’ATGGTTCCTGTACCAAGGAC3’5’ATGGCTCCTGTACCGAGGAC5’3’正常等位基因突变等位基因Tm=54℃Tm=58℃46℃50℃54℃58℃62℃－＋正常基因突变基因（二）突变的检测原理正常等位基因点突变突变杂合子稳定遗传突变纯合子PCR扩增wt/wtwt/wt,mt/mt,wt/mt,mt/wtmt/mtPCR产物基因型TGGE123456123456a异源b双链带c同源d双链带1，5，6为点突变的杂合子；2为突变的纯合子；3，4为野生的纯合子.TGGE（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）实验实验原理与TGGE一致，只不过在DGGE中，变性条件取代了TGGE的温度。在DGGE试验中，有2个变性条件：热：一般采用60℃的恒定温度；变性剂：固定比率的甲酰胺、尿素TGGE/DGGE如果想要获得很好的实验结果，还有耐于利用相关软件优化实验条件：电泳时间、凝胶的浓度、变性的梯度等。（四）临床应用1.广泛应用于疾病基因的突变检测，尤其是一个等位基因发生突变就会引起的疾病检测；2.筛选人类基因的多态性；3.人类基因的突变检测，如P53、FBN1等基因；4.线粒体DNA中的基因突变及多态性检测；5.粪便及肠内微生物多态性的鉴定；6.病毒基因组的突变鉴定及不同病毒株之间的基因组差异鉴定。TGGE/DGGE（五）方法学评价高分辨率，能100%检出对单个碱基突变的基因；结合GC夹、补骨脂素夹或双边夹，可提高其灵敏度，获得更高的检出率。TGGE/DGGE优点缺点合成带GC夹的引物需要特定的仪器，成本较高。色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，其原理是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。高效液相色谱：以液体为流动性，高速、高效率地分离混合物的一种色谱技术。变性高效液相色谱：改进传统高效液相色谱的分离系统，并运用变温分析方式，高效分离各种生物大分子（包括DNA）的一种方法。四、变性高效液相色谱法（denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)DHPLC排阻色谱亲和色谱（一）DHPLC的基本原理1.DHPLC的分离系统2.DHPLC分离DNA的原理3.DHPLC检测突变的原理DHPLC1.DHPLC的分离系统DHPLC1.色谱柱的填料特性：电中性，疏水性固定相:C18基质：聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB)2.离子对试剂：三乙基铵醋酸盐（TEAA）特性：带正电荷，疏水性3.流动相：乙腈特性：通过改变浓度，将DNA分子按结合程度的不同，逐步洗脱下来。PO3-TEAAC182.DHPLC分离DNA的原理DHPLCDHPLC3.DHPLC检测突变的原理变性后，缓慢退火分离手段：①非变性分离②部分变性分离③完全变性分离（二）临床应用1.乳腺癌相关基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相关基因的分子检测；2.短的串联重复序列的基因分型；3.肿瘤样本中杂合性缺失的检测；4.Y染色体和常染色体DNA序列的筛查5.酵母、拟南芥、果蝇及小鼠的基因组作图及基因克隆。DHPLC（三）方法学评价优点：具有更高的准确性和敏感度。DHPLC检测特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA测序检出范围300bp100-500bp150-600bp0.5%的变异20%的变异检出率50%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夹辅助，增加了工作量快速，2-3min费时费力错配接合蛋白质截短测试法（PTT）：又称为体外蛋白质合成检测技术(IVPS),只检测与疾病相关的突变，即检测使蛋白不能全长翻译的突变。五、错配接合蛋白质截短测试法（proteintruncationtest,PTT)（一）PTT的原理PTT检测基因缺失、异常的复制或剪接检测翻译终止突变（二）临床应用1.最早被用于杜氏肌营养不良的检测；2.家族性腺瘤样息肉病；3.遗传性硬纤维瘤病；4.共济失调—毛细血管扩张症；5.遗传性乳腺癌；6.卵巢癌等。PTT（三）方法学评价优点：PTT1.不仅可检测出只与疾病相关的蛋白截短突变，还能检测出在RNA形成过程中发生的突变。2.可以直接采用mRNA进行检测，减少了操作步骤，加快了分析进程；3.只鉴定引起疾病的截短突变，不会受到基因沉默的影响；4.截短蛋白质分子的长度指明了突变的位置，可以更方便地进行DNA测序分析以确定突变。DHPLC缺点：1.最佳检测范围为2kb的基因组或1.3-1.6kb的cDNA，因此对于序列较长、包含多个外显子的疾病基因，需要分几次进行检测；2.PTT因为凝胶的分辨率，而检测不出编码序列中小的插入或错义突变；3.引起RNA产量改变或使mRNA不稳定的突变可能被漏检。谢谢！第二节脉冲电场凝胶电泳交替采用两个方向的不均匀电场，使DNA分子在连续间隔交替的电场中，不断改变方向运动，从而将DNA按分子大小分开的电泳技术。脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)特点：能分离50kb-10Mb的DNA片段。在PFGE中，电场的方向、脉冲时间和电压大小可交替改变。在每次电场方向改变时，DNA分子都需要时间来改变其分子构型和迁移方向。DNA分子越大，分子构型转换所需的时间越长，转变迁移方向的时间也越长。不同大小的DNA分子，因为其改变泳动方向的时间不同，迁移速度也就不同，从而可以在脉冲电场中很好地分开。一、PFGE的原理二、PFGE的一般步骤真核或原核细胞1.包埋2.原位裂解3.限制性酶切4.脉冲电泳5.结果分析原位裂解获得完整的染色体DNA与琼脂糖混合制备包埋块（含有染色体）限制性酶切后电泳三、PFGE的种类1.倒转电场凝胶电泳（field-inversiongelelectrophoresis,FIGE）2.交流电场凝胶电泳（transverse-alternatingfieldgelelectrophoresis,TAFE）3.钳位均匀电场凝胶电泳（contour-cla