第五章实验动物微生物学-实验动物微生物学和寄生虫学质量控制

第五讲实验动物微生物学和寄生虫学质量控制学习内容实验动物微生物学、寄生虫学质量控制分类实验动物的微生物学、寄生虫学质量监测实验动物主要疫病及人兽共患传染病实验动物防疫第一节按微生物和寄生虫学质量控制分类实验动物分类定义举例普通级动物（Conventionalanimal，CV)是不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性染病病原的动物。如鼠痘病毒、流行性出血热病毒、弓形虫等。清洁级动物(Cleananimal,CL)是指除普通动物应排除的病原外，还应不携带对动物健康危害和对科学研究干扰较大的病原的动物。如鼠肝炎病毒、仙台病毒、体外寄生虫等。无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimal,SPF)是指除清洁动物应排除的病原外，还应不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的动物。如绿脓杆菌等。无菌动物（Germfreeanimal,GF)是指在动物体内无可检出一节生命体的动物。无检出。以上根据国标GB14922.1-2001,GB14922.2-2001大鼠和小鼠无普通级，犬和猴无清洁级及无菌级。实验动物质量保障体系第二节实验动物的微生物学、寄生虫学质量监测(一)实验动物的微生物、寄生虫感染的危害1、影响实验结果。如仙台病毒感染引起小鼠肺鳞状化病变；小鼠肝炎病毒感染引起血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高。2、影响动物生产。如鼠痘、兔出血热病毒、犬细小病毒性肠炎的感染导致动物的大批死亡。3、威胁人类健康。如汉坦病毒、钩端螺旋体感染人致病或致死。4、污染实验材料。如用于疫苗生产的原材料SPF鸡胚污染病毒，接种疫苗导致病原的扩散。5、寄生虫对实验动物的影响。1）掠夺宿主的营养；2）体外寄生虫对动物的骚扰；3）对宿主机体产生机械性损伤;4）对宿主产生毒性作用；5)对宿主生理、生化和免疫系统产生影响。（二）监测意义1、保证实验研究的顺利进行和工作人员的身体健康。2、确保实验数据的准确性和可重复性。（三）监测方法实验动物的微生物、寄生虫检测具体操作方法详见《国家标准实验动物微生物学检测方法》（GB/T14926.1-14926.64）和《国家标准实验动物寄生虫学的检测方法》(GB/T18448.1～18448.10)。检测方法归纳起来有病原学检测和血清学检测。细菌、真菌和寄生虫以病原学检测为主，血清学检测为辅；但有些病原体也逐渐使用血清学方法检测，如支原体、泰泽氏病原体、弓形体等。病毒的常规定期检测以血清学为主，而疾病诊断则以病原学检测为主。包括监测项目的选定、采样数量、检测频率、采样方法、病毒、细菌、寄生虫和真菌检测方法。1、监测项目我国经过十多年来对各地实验动物感染病原微生物、寄生虫情况的调查，结合其他国家的规定和经验，制定了我国啮齿类、兔、犬、猴和鸡的微生物学以及寄生虫学等级标准。目前有关实验动物的标准有28个。颁布年代主要在2001年，最近对标准又进行了部分修订。GB14925实验动物环境与设施GB14923实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制GB14922.1实验动物寄生虫学等级及检测GB14922.2实验动物微生物学等级及检测GB14924.1实验动物配合饲料通用质量标准GB14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物小鼠、大鼠配合饲料GB14924.4实验动物兔配合饲料GB14924.5实验动物豚鼠配合饲料GB14924.7实验动物犬配合饲料GB14924.8实验动物猴配合饲料GB14924.6实验动物地鼠配合饲料GB/T14927.1实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测方法GB/T14927.2实验动物近交系小鼠、大鼠皮肤移植法GB/T14926.42～14926.43实验动物微生物学检测方法（1）GB/T14926.1～14926.6实验动物微生物学检测方法（2）GB/T14926.8～14926.17GB/T14926.41GB/T14926.44～14926.49GB/T14926.50～14926.55实验动物微生物学检测方法（3）GB/T14926.18～14926.32实验动物检测方法（4）GB/T14926.56～14926.64GB/T18448.1～18448.10实验动物寄生虫学检测方法GB/T14924.9实验动物配合饲料常规营养成分的测定GB/T14924.10实验动物配合饲料氨基酸的测定GB/T14924.12实验动物配合饲料矿物质和微量元素的测定GB/T14924.11实验动物配合饲料维生素的测定GB/T17998SPF鸡微生物学监测总则标准要求检测的项目分为必须检测项目和必要时检测项目。必须检测项目：是指在进行实验动物质量评价时必须检测的项目。必要时检测项目：是指从国外引进实验动物时；怀疑有本病流行时；申请实验动物生产许可证和实验动物质量合格证时必须检测的项目。我国的实验动物微生物和寄生虫检测标准是我国实验动物质量要求的最低标准，各个地区和生产企业还可以根据当地疾病的流行情况，或者提高企业产品制定相关标准，但要求不能低于国家标准要求。与国外标准相比较，我国的标准要求还是偏高，主要表现在条件致病菌检测方面。SPF级动物监测项目类别病原菌病毒寄生虫动物种类小鼠、大鼠豚鼠、兔犬、猴小鼠、大鼠豚鼠、兔犬、猴小鼠、大鼠豚鼠、兔犬、猴项目沙门菌、支原体、泰泽病原体等沙门菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌等志贺菌、结核杆菌等鼠痘病毒、汉坦病毒、仙台病毒和小鼠肝炎病毒等兔瘟、仙台病毒等B病毒、逆转录病毒等体外寄生虫、弓形体等弓形体、兔脑原虫、球虫等弓形体、溶组织阿米巴等数量(项）161491489765我国实验动物质量要求的最低标准，其它行业、地方标准不能低于国家标准要求。2、采样数量我国国家标准规定：•选择成年动物用于检测。•取样数量：每个小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠和兔生产繁殖单元；以及每个犬、猴生产繁殖群体，根据动物多少，取样数量见表。群体大小（只）取样数量〈100不少于5只100-500不少于10只〉500不少于20只隔离器每个检测2只3、检测频率普通级动物：每三个月至少检测动物一次。清洁级动物：每三个月至少检测动物一次。无特定病原体动物：每三个月至少检测动物一次。无菌动物：每年检测动物一次。每2-4周检查一次动物的生活环境标本和粪便标本。一般来说，一旦病原体入侵动物群体引起感染，初期分离病原体较容易，随后抗体的检出率上升，2-3个月后可因某些个体抗体水平的降低以及新出生的非感染个体的增加等原因，抗体检出率下降。4、采样方法可用随机抽样法或哨兵动物法。随机抽样法采样时，宜在动物群中不同方位随机采取成年动物，选择至少4个不同的位置采集样品（例如四角和中央）。哨兵动物法将经过检测符合质量要求的同种系实验动物即哨兵动物放入群内，不时调换位置，饲养一定时间后解剖检查抗体或病原。采样样品从采样点到检测实验室运输途中应保证动物的安全和避免污染。一般来说，无论病原学或血清学检测，检测结果阳性者表示该群动物有该病原体感染的存在。但作为疾病病原体的确定，还需要进一步分析。如果检测结果阴性，一般来说可作为无此病原体存在的依据。但检测结果亦受多种因素的影响。如:取材数量、感染率的高低、取材频率、取材对象(动物年龄、疾病的早晚期等)、方法学的选择(病原学或血清学检测)、方法学的敏感性等，均与检测结果密切相关。5、检测方法-病毒检测包括血清学检测和病原学检测。（1）血清学检测：适用于各级各类实验动物的经常性检测和疫情普查。常用的方法有:酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)、免疫酶染色试验(IEA)、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验、补体结合试验、琼脂扩散实验等。（2）病原学检测：适用于动物群中有疾病流行，需要检出病毒或确认病毒存在的情况。检测方法有:病毒分离与鉴定，病毒颗粒、抗原或核酸的检出，潜在病毒的激活，抗体产生试验等。例如:采用免疫组化的方法在光镜下检查病变组织中的特异性抗原；采用HA方法检查患病动物排泄物或组织悬液中的血凝素抗原;采用电镜技术或免疫电镜技术检查组织或排泄物中的病毒颗粒;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检查病毒的蛋白质;采用核酸分子杂交技术或聚合酶链反应(PCR)检出组织或排泄物中的病毒核酸。检测方法-细菌检测最常用的方法是病原菌的分离与培养或进行动物接种。部分病原菌，如:布氏杆菌、支原体等，可采取血清学方法。对于泰泽氏病原体，由于不能在人工培养基上生长，因此宜采用血清学检测方法，动物诱导实验进行组织压片、镜检的方法进行检查，并结合病理检查结果最后做出诊断。检测方法-真菌检测目前主要采用沙氏培养基分离培养。皮肤真菌通常在25℃培养，深部真菌通常在37℃培养。不同的真菌具有一定的菌落特点，结合镜下染色检查可进行种属鉴定，有时，还需借助于生化反应结果和免疫学方法进行最后诊断。检测方法-寄生虫检测（1）体外寄生虫：如肉眼观察法、透明胶纸粘取法、拔毛取样法、皮屑刮取法、黑背景检查法、解剖镜下通体检查法等，主要适用于检查蚤、虱、螨等节肢动物。（2）体内寄生虫：主要检查蠕虫和原虫，可用直接涂片法(粪便、血液、脏器、肠内容物)、饱和盐水漂浮法或沉淀法、透明胶纸肛门周围粘取法、组织或器官剖面压印法、病变组织切片或压片法、尿液的离心法(如检查鼠膀胱线虫)等。我省近5年实验动物微生物、寄生虫感染状况动物等级动物种类携带病原微生物和寄生虫细菌病毒寄生虫普通级动物兔、豚鼠皮肤真菌B病毒体外寄生虫清洁级动物小鼠、大鼠-小鼠肝炎病毒蠕虫SPF级动物小鼠、大鼠嗜肺巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、泰泽病原体小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、大鼠冠状病毒蠕虫、鞭毛虫国外小鼠病毒感染情况病毒种类方法样本数感染状况（%）北美欧洲总数鼠痘病毒血清学2468570.020.000.02汉坦病毒血清学1449460.000.000.00K病毒血清学2253530.000.000.00淋巴细胞脉络丛病毒血清学2414530.010.020.01小鼠腺病毒1和2血清学2303510.020.220.02小鼠巨细胞病毒血清学1465110.040.000.04小鼠肝炎病毒血清学5586731.573.251.59小鼠诺沃克病毒血清学4487632.6424.0332.37小鼠细小病毒NS-1血清学5784641.651.921.65小鼠细小病毒1和2血清学5945391.833.641.86小鼠微小病毒血清学5959030.330.460.33小鼠肺炎病毒血清学4476560.010010.01多瘤病毒血清学2258680.020.200.02呼肠孤病毒血清学4288210.010.050.01乳鼠腹泻病毒血清学4665720.560.350.56仙台病毒血清学4622090.000.000.00小鼠脑脊髓炎病毒血清学4357720.260.270.26细菌种类方法样本数感染状况（%）北美欧洲总数支气管败血波氏杆菌培养1098020.000.000.00呼吸道相关纤毛状杆菌血清学1587410.010.000.01鼠类柠檬酸杆菌培养823370.000.000.00鼠棒状杆菌培养1098040.000.000.00螺杆菌属PCR9111915.8821.2816.08肝螺杆菌PCR9146312.4510.2312.37胆汁螺杆菌PCR913862.201.492.17产酸克氏杆菌培养1859370.381.320.38肺炎克雷伯菌培养1866670.100.850.10肺支原体培养、血清、PCR61592455102437770.000.010.00Nt0.16Nt0.000.010.00多杀巴氏杆菌培养1093760.000.000.00嗜肺巴氏杆菌培养10940313.24.0012.90其它种培养1062320.310.000.31任一种沙门氏菌培养1096550.000.000.00金黄色葡萄球菌培养1070026.0311.566.07念珠状链杆菌培养28420.000.000.00肺炎链球菌培养1098040.000.000.