第八章-钼酶及含钼蛋白(固氮酶)

第八章钼酶及含钼蛋白(固氮酶）第一节概述第二节固氮酶第三节双氮的配位化学第四节固氮酶的模拟第五节钼转氧酶及其模拟第一节概述在生物体中，钼是唯一的第二过渡元素。钼酶的相对分子量较大，纯化困难，且钼易于发生价态变化，钼的价态多，存在的状态复杂，因此关于钼酶的许多问题仍未弄清楚。钼是人体生长必需的微量元素。在机体内的分布很广，在所有器官、组织和体液中均能检出。钼是多种酶的辅助因子；钼参与酶类和蛋白质合成，参与维生素B12组成及代谢，促进红细胞发育和成熟，防止贫血，促进核酸和蛋白质合成等很多生理过程。钼缺乏：钼缺乏时会诱发心肌病或其它心血管病。缺钼，还可诱发食道癌、骨癌、肝癌以及龋齿。孕妇缺钼可引起胎儿发育障碍。钼过量：过量的钼可诱发痛风和癌症。某些含钼的食物食物来源不同,其钼的含量差异较大。一般而言,植物性食物以豆类及其制品含量最丰富。动物性食物以海产品中含量最高,其次是动物的肝脏和肾脏。钼主要通过在食物链中的迁移进入人体内。钼在人体内主要分布钼(molybdenum)广泛存在于水、土壤以及各种动植物体内。钼在人体内主要分布在肝脏和肾脏。人体血液中钼的含量能较好地反映出体内钼的摄入情况。中国营养学会2000年制定的中国居民膳食营养素参考摄入量规定，成人钼的推荐摄入量是60微克/天，可耐受最高摄入量350微克/天。一些钼酶的主要成分钼酶来源相对分子质量铁钼含量/分子其他组分MoFe黄嘌呤氧化酶牛乳275000282FAD黄嘌呤脱氢酶鸡肝300000282FAD醛氧化酶兔肝300000282FAD硝酸盐还原酶粗糙脉孢菌2300001～FAD,cyt.b亚硫酸氧化酶小牛肝110000244cyt.b固氮酶棕色固氮菌270000232Cys所有与钼有关的金属蛋白和金属酶均与氧化还原有关，并参与生物体内的电子传递。钼酶的组成比较复杂，某些钼酶如固氮酶，黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤脱氢酶除了含钼辅酶外，还含有铁硫蛋白或黄素腺嘌呤二核苷酸；另一些钼酶如硝酸盐还原酶，亚硫酸盐氧化酶还含有细胞色素。钼酶中的铁硫蛋白或细胞色素一般充当电子传递媒介，钼活性中心则起着底物结合对底物进行氧化还原等生物催化作用。钼酶可按其结构和功能的差异分为固氮酶和转氧酶。RepresentativeMolybdoenzymesEnzymeReactionNitrogenaseaN2+6H++6e-→2NH3NitratereductaseNO3-+2e-+2H+→NO2-+H2OSulfiteSO32-+H2O→SO42-+2H++2e-XanthineoxidaseaNitrogenasecontainsaFeMo-ClustercotactorAllotherenzymescontainMo-pterrnHNNHNHNOO+H2OHNNHNHNOOOH+2H+2e-+xanthineuricacid钼辅基：蝶呤辅酶钼转氧酶分为氧化酶和还原酶。氧化酶为加氧过程；还原酶为失氧过程：黄嘌呤+O→尿酸NO3-→O+NO2-（MoIV→MoVI）SO32-+O→SO42-(MoVI→MoIV)CO2→O+CORCHO+O→RCOOH钼转氧酶的催化反应与电子传递和钼价态有关。NHHNHNNOH2NSMoSCCLL'OXCHCH2ROH(X=S,O)R=OPO32-R=adenosine-OP3O33-第二节固氮酶(Nitrogenase)常温常压下高效地把N2转化为NH3；19世纪80年代，HellriegelandWilfarth首先发现并证实自然界中生物固氮的存在，之后人们发现生物固氮广泛发生于微生物和原核生物中。已经发现至少200种微生物具有生物固氮功能。目前世界每年消耗近1亿吨尿素用于农业，生物固氮提供了全球所需氮肥量的75%（3亿吨尿素）。N2+8H++16MgATP+8e2NH3+H2+16MgADP+16PO43-工业生产尿素需要高温高压消耗大量的能源，同时污染大气，造成对环境的第一次污染；同时所用化肥仅有30%被农作物利用，大部分进入地下水，对环境造成第二次污染。固氮微生物在常温常压下利用可再生能源固定空气中的氮素，并直接被植物吸收利用，对环境不产生任何污染。早日实现人工生物固氮是当前生物无机化学及相关学科发展的一个重要目标！！！人类对生物固氮的认识直到20世纪60年代采取得了突破性的进展。①第一次从细胞水平上观察到在ATP存在下的生物固氮现象。这极大的刺激了固氮酶的生物化学研究和发展；②随后活性酶从生物体内被分离提纯出来，人们利用各种物理方法对固氮酶进行更深入地研究；③同时，科学家开展了在过渡金属配合物存在下，氮气在溶液中的化学反应，第一个过渡金属双氮配合物被合成出来，且出乎意料的稳定；其后，许多分子氮配合物被相继合成出来，并研究它们在溶液中的还原反应（质子化后可形成肼和氨）。……固氮酶的分离提纯，在溶液中氮分子的还原以及过渡金属双氮配合物的的制备三方面是相互关联又相互促进的。在相当长的一段时间里，固氮酶的结构和生物固氮机理一直是科学家们努力探求的目标。20世纪70年代，成功分离出固氮酶活性中心铁钼辅基，测定了构成固氮酶的铁蛋白和钼铁蛋白的单晶结构，到目前（1993年）为止已经测定了1.16Ả高分辨率的钼铁固氮酶的晶体结构。在人工固氮酶的研究上取得了重大进展。固氮酶催化下列反应NH3+6H+HCN+CH46eNH2NH2+6H+CH3CN+CH46eNH3+7H+N3-+N2H46e+4H+HCNCH3NH24eNH3+3H+N3-+N22eH2O+2H+N2O+N22e+2H+C2H2C2H42e2H+H22eCHHCCH2+6H++6eCH2H2CCH2H3CCHCH2生物固氮体系可以分为自生和共生固氮两种类型；部分固氮微生物只有在有氧的环境中才能有固氮功能；另外一种固氮微生物在缺氧的条件下能够固氮；此外还有一些固氮微生物在需氧和厌氧的条件下均可以自由固氮；根据固氮酶所含金属的种类，固氮酶主要分为三类：钼固氮酶，钒固氮酶和铁固氮酶每类固氮酶均有两种金属蛋白组成，除铁蛋白外，还含有另一种钼铁蛋白（MoFe）或钒铁蛋白（VFe）或铁铁蛋白（FeFe）。大豆根瘤菌1993年，Rees等得到了分辨率为0.22nm的葡萄球固氮菌和巴氏芽孢菌固氮酶钼铁蛋白的射线结构数据，基本上确定了固氮酶的结构。它是由铁蛋白和钼铁蛋白两种相对独立，相互分离的纯蛋白组成。铁蛋白是一种依赖于供给能量的电子传递体，具有把电子传递给钼铁蛋白的功能；钼铁蛋白是结合底物分子和催化底物还原的部位。固氮酶的组成钼固氮酶的结构铁蛋白是个α2二聚体，含有一个[Fe4S4]2+/1+原子簇桥联两个亚基。MoFe蛋白（Mo-FeProtein,α2β2四聚体）的每一个αβ对含有一对[Fe4S4](即P原子簇)和一个FeMo辅因子(M原子簇)；钼铁蛋白的晶体结构钼固氮酶的结构及电子传递钼固氮酶中铁蛋白的结构各种不同类型的微生物固氮菌的铁蛋白均已经分离、纯化，并进行了非常透彻的研究，他们的大小和功能大同小异。他们均是由两个相同的亚基形成的二聚体，分子量约60000Da,两个亚基之间通过四个半胱氨酸上的硫原子桥联着一个Fe4S4原子簇结构。Fe4S4原子簇单元位于蛋白球的表面，易于接近溶剂分子，因而铁蛋白对氧化极度敏感。主要功能：1.电子传递媒介的作用；[Fe4S4]2+，[Fe4S4]+2.它的存在是生物合成FeMo辅酶所必需的；3.它的存在对FeMo辅酶插入改性的缺FeMo辅酶的钼铁蛋白是必要的。P-cluster：电子从铁蛋白金属簇中心传递到FeMo-辅酶中心的桥梁作用。还原态氧化态由于M-簇是固氮酶固氮成氮的活性中心所在，对它的研究早已引起许多化学家的重视。对比，自1973年以来国内外学者根据结构化学、化学键理论、络合催化原理和化学探针等方法就提出的固氮酶网兜模型，骈联活口双立方烷模型等十几种原子簇模型，都是以Mo为结合底物的核心原子，自然界里为了有效地固氮成氮而演进出的这种独特的活性中心结构，显得比人们的智慧推想更为周到。根据这新的信息，对固氮酶活性中心的结构与功能的研究将会有新的突破。M-簇的重要性FeMo-辅酶与蛋白结合部位不多，相对松弛，故易提取；MoFe-Co（M簇）M簇中相邻的Fe-Fe间的距离为2.58-2.67Ǻ；Mo-Fe的距离为2.67-2.73Ǻ,这意味着Fe-Fe和Mo-Fe之间存在着一定程度的金属-金属键合作用。MoFe-Co（M簇）电子传递机制？铁蛋白的循环？钼铁蛋白的催化循环？氢化酶何以体现？催化过程中，氮气与铁结合还是与钼结合？ATP何处提供？有无特异性？……N2+8H++16MgATP+8e2NH3+H2+16MgADP+16PO43-1.电子传递机制铁蛋白与FeMo辅酶间的距离为32Ǻ，因此他们之间直接进行电子传递是不可能的。FeP(MgATP)2+MoFePFePOX(MgATP)2+MoFePFePOX(MgADP,Pi)2MoFePFeP(MgATPH)2MoFePH2ATP水解电子转移能量传导磷酸根释放核苷置换还原作用复合物形成复合物解离K4K1K-1K3K-3K22.固氮酶中铁蛋白循环图3.固氮酶中钼铁蛋白循环图4.固氮酶与底物结合的可能部位与钼结合底物与钼铁蛋白辅基的结合位置和方式仍然是悬而未决的问题，有待人们进一步深入研究。可能与铁结合的部位钒固氮酶VanadiumNitrogenase钒固氮酶在无氧条件下才有催化活性。钒固氮酶在还原N2的过程中利用其50%的自身还原等价物产生H2，而钼固氮酶仅利用25%。因此，钒固氮酶的催化活性不如钼固氮酶，只有在土壤中钼缺乏的条件下，生物才会采用钒固氮系统。但钒固氮酶具有钼固氮酶不及的优点:(1)低温(如5℃时)和酸性环境下钒固氮酶比钼固氮酶还原效率高;(2)钒固氮酶除将乙炔还原为乙烯外，还部分还原为乙烷;(3)钒固氮酶具有明显的氢化酶活性;(4)钒固氮酶可在N2还原过程中产生少量中间体肼。化学通报，2007,4,270第三节双氮过渡金属配合物1965年，A.D.Allen在常温常压下合成了第一个双氮过渡金属配合物[Ru(NH3)5(N2)]Cl2，改变了氮分子不活泼的观念，提供了活化分子氮的途径。通过研究双氮配合物获得生物固氮信息的希望激励科学家深入探索更多的例证。目前已经合成数百种双氮配合物。这一研究成果开辟了一个新的研究领域，推动人们探索生物固氮的秘密。1．氮分子的不活泼性最高占有轨道3σg的能量较低，-15.6eV，而最底空轨道3σg的能量较高，-7.0eV。即将电子从N2完全转移到受体或从电子供体完全转移到N2都很困难。因此N2即不容易氧化也难以还原。N2分子通过什么途径活化是化学模拟生物固氮研究的重大课题。氮分子轨道能级与电子云分布2．双氮配合物的成键方式：端基配位和侧基配位178°PPPHNNCo[CoH(N2)(PPh3)3]的结构NNP[{(NH3)5Ru}2(N2)]4+的结构NLiLiLiNiNLiNiLiLiLi[{C6H5Li}6Ni2N2(Et2O)2]2]]的结构（略去了苯基和醚）3.氮分子配位活化在端基配位的双氮过渡金属配合物中，氮原子经过适当的π*分子轨道与金属d轨道重叠，按照N2➝金属σ成键及金属➝N2π成键方式，从末端与金属结合。侧基配位的σ键形成降低了两个氮原子之间的电子云密度，反馈π键更削弱了两个氮原子的结合强度，这两种作用都促使N2活化，其中又以反馈π键为主。端基配位与侧基配位的双氮过渡金属配合物的成键方式中心金属原子具有低氧化态，电子构型多为d5-d10。共配体的Lewise碱越强，越有利于形成反馈π键，N2活性越大。与端基配位相比，侧基配位双氮配合物的双键更长，N2活性越大。配合物双氮键长νN≡N/cm-1N2109.82331[Ru(NH3)5(N2)]2+1122114[Os(NH3)5(N2)]2+1122208[Os(NH3)4(CO)N2]2+2108[Mo(N2)2(diph