用HPLC-ESI-MS对加速样品进行分析

液相色谱-质谱联用技术在药品质量控制中的应用天津市药品检验所吴燕一、液相色谱-质谱联用技术介绍1、概述高效液相色谱一质谱联用法(HighPerformanceLiquidChromatography—MassSpectrometry，HPLC—MS)是一种将待测样品通过液相色谱分离后，流出液经接口部分或全部进入离子源。所产生离子在加速电压的作用下，进入质谱质量分析器，按照离子的质荷比大小分离并列谱的分析方法。HPLC—MS适用于极性强、挥发度低、分子量大及热不稳定的混合有机物体系。与气相色谱质谱联用技术(GasMassSpectrometry)相比，气相色谱质谱联用技术发展较早，技术较为成熟，但GC样品要求有一定的蒸汽压，实际应用中只有少部分样品可以不经过预先处理可达到GC的分离要求，多数情况下需要做预处理或衍生化使之成为易气化的样品才能进行GC-MS分析；而液相色谱不受上述限制，可分离高极性的和热不稳定的化合物，这使得液相色谱质谱联用技术具有更广阔的应用前景。2、液相色谱-质谱联用技术的特点高效液相色谱是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是化合物(或单质)固有特性之一，不同的化合物除一些异构体外，均有不同的质谱，利用这一性质可进行定性分析。对于色谱工作者来说，质谱仪的使用可以：1、作为液相常规检测器（紫外、荧光、电化学等等）的补充；2、质谱仪是通用性检测器，响应值与分子中的某个特定基团无关；3、质谱仪是质量数型检测器，可以获得待测物的分子量信息；4、质谱仪可同时提供定性和定量分析的结果。对于质谱工作者来说，与液相色谱联用可以：1、分析不能用GC测定的化合物（大分子、极性、热不稳定性化合物）；2、通过液相的高分离性能，提供更多的有关物质结构信息；3、通过流动注射技术，实现全自动的探索分析。3、液相色谱-质谱联用仪组成及原理高效液相色谱一质谱联用仪(HPLC／MS)通常由液相色谱系统、进样接口、离子源、质量分析器、检测器、计算机控制及数据处理系统、真空系统等构成。3.1进样系统高效液相色谱一质谱联用仪的进样方式有直接进样和柱后分离进样两种方式，将试样导入质谱仪。3.2离子源样品进行质谱检测时，需将中性样品(不带电性)变成带正电荷的离子或带负电荷的离子才能检测，在质谱仪中实现此过程的装置叫离子源。3.2.1离子源的分类及特点从质谱的离子源角度来划分，主要包括：热喷雾(TSP)，等离子体喷雾(PSP)，粒子束(LINC)，大气压电离(API)和动态快原子轰击(FAB)。离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。API技术是当今质谱界最为活跃的领域，它是一种常压电离技术，不需要真空，减少了许多设备，使用方便，因而近年来得到了迅速的发展。API主要包括电喷雾离子化(ESI)，气动辅助电喷雾即离子喷雾离子化(ISI)和大气压化学离子化(APCI)3种模式。它们的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度和稳定性。（1）电喷雾离子化(ESl)工作原理样品溶液从毛细管流出时，在电场的作用下喷射形成带电雾状微液滴，在加热条件下，液滴内溶剂蒸发，液滴直径不断变小，使表面电荷密度不断增加，当达到雷利限度，即表面电荷所产生的库仑斥力与液滴的表面张力相等或超过时，液滴即爆裂，从而产生更小的液滴。此过程不断重复，直到液滴变得足够小，表面电场足够强，最终把样品离子从液滴中解吸出来，形成样品离子进入质量分析器被检测。ESI的适用范围：中等极性或极性有机分子，配合物，蛋白质，多肽，糖蛋白，核酸及其他多聚物。（2）离子喷雾离子化(ISI)工作原理与ESI基本相同，但液滴的形成借助气流雾化的帮助。（3）大气压化学电离(APCI)工作原理APCI是由ESI派生出来的，它是利用大气压下电晕放电来产生反应离子，这些反应离子再与样品分子发生离子分子反应，从而产生样品分子的带电离子或加合离子被质谱检测。APCI主要应用于低极性或中等极性小分子分析，要求待测化合物易挥发且有一定的热稳定性。由于极少形成多电荷离子，分析的分子量范围受到质量分析器质量范围的限制。3.3质量分析器将带电离子根据其质荷比进行分离，用于记录各种离子的质量数和丰度。根据结构的差异，质量分析器包括扇型磁场质量分析器、四极杆质量分析器、离子阱质量分析器、飞行时间质量分析器及傅立叶变换离子回旋共振质量分析器。3.3.1四极杆质量分析器仪器由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。当离子束进入筒形电极所包围的空间后，离子作横向摆动，在一定的直流电压、交流电压和频率，以及一定的尺寸等条件下，只有某一种（或一定范围）质荷比的离子能够到达收集器并发出信号（这些离子称共振离子），其他离子在运动的过程中撞击在筒形电极上而被“过滤”掉，最后被真空泵抽走（称为非共振离子）。如果使交流电压的频率不变而连续地改变直流和交流电压的大小（但要保持它们的比例不变）（电压扫描），或保持电压不变而连续地改变交流电压的频率（频率扫描），就可使不同质荷比的离子依次到达收集器（检测器）而得到质谱图。3.3.2离子阱质量分析器离子阱质量分析器（iontrapMassAnalyser）实际是一种三维空间旋转对称四极杆质量分析器。离子阱由一个双曲线表面的中心环形电极和上下两个端电极间形成一个室腔（阱）。直流电压和高频电压加在环形电极和端盖电极之间，两端电极都处于地电位，在适当条件（环形电极半径、两端电极的距离、直流电压、高频电压）下，由离子源（EI或CI）注入的特定m/z的离子在阱内稳定区，其轨道振幅保持一定大小，并可长时间留在阱内，反之不稳定态离子（未满足特定条件者）振幅很快增长，撞击到电极而消失，质量扫描方式和四极滤质器相似，即在恒定的直流交流比下扫描高频电压以得到质谱图。3.3.3飞行时间质谱仪飞行时间质谱是应用不同的m/z离子的飞行速度不同，离子飞行通过相同的路径到达检测器的时间不同而获得质量分离。飞行时间质谱仪特点为：（1）质量分析器既不需要磁场，又不需要电场，只需要直线飘移空间。因此，仪器的机械结构较简单。（2）扫描速度快，可在10-5～10-6s时间内观察、记录整段质谱，使此类分析器可用于研究快速反应。（3）不存在聚焦狭缝，因此灵敏度很高。（4）测定的质量范围仅决定于飞行时间，可达到几十万u。3.3.4傅立叶变换质谱仪傅立叶变换质谱是近十几年发展的一种新技术，其工作原理与上述几种质量分析器有本质的差别，该技术应用快速傅立叶变换方法将离子的频率信号转换为质谱信号。优点是分辨率高，而且灵敏度随分辨率提高而提高。3.3.5质量分析器的主要技术参数分辨率（Resolution）灵敏度（Sensitivity）质量范围（MassRange）（1）理论分辨率规定为两个质量为M1和M2的相邻质谱峰刚好分开时仪器的分辨本领，用R表示，即两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。（2）灵敏度是表示质谱峰强度与所需样品量之间关系的量度。目前有机质谱的灵敏度的测试一般用某一浓度的利血平(Reserpine)，绝对进样量为pg级时所产生质谱信号的信噪比(S／N，即峰高与基线宽度之比)表示。一般来说，有机质谱仪的分辨率和灵敏度是相互制约的。（3）有机质谱仪的质量范围是指仪器能够准确测定离子的最大质量数。最大质量数的获得与加速电压有直接的联系。加速电压同质荷比m／z成反比，降低加速电压，可提高所测的最大质量数，但同时会造成分辨率和灵敏度的降低。3.4、串联质量分析器二级质谱串联是选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1)，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体(常用气体为He，Ar，Xe，CH4等)进行碰撞诱导裂解(CID)，发生离子-分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2)进行分析。串联质量分析器的优势在于不仅能够提供分子量信息，而且可以提供分子结构信息。MS/MS仪主要有3种数据采集方式:（1）子离子扫描：选择一定的母离子经CID活化，MS2记录产生的子离子。（2）母离子扫描：选择MS2中的某一子离子，测定MS1中的所有母离子。（3）中性丢失扫描：MS1和MS2同时扫描，但MS2与MS1始终保持质量差Δm，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片(Δm)的离子。3.5检测器质谱检测器通常为光电倍增器或电子倍增器，电子倍增器（又称转换打拿极，ConversionDynode）将离子流转化为电流，所采集的信号经放大并转化为数字信号，通计算机处理后得到质谱图。3.6真空系统有机质谱仪的真空系统一般为大抽速机械泵和涡轮分子泵组合构成差分抽气高真空系统，其真空度需达到1.33×10-2～10-5Pa，即10-5mmHg～10-7mmHg。3.7数据处理在液质联用过程中，不同组分的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图，即质量色谱图。亦可固定某质荷比，对整个色谱流出物进行选择离子检测(SelectedlonMonitoring，SIM)，得到选择离子流图。质谱离子的多少用丰度(Abundance)表示，即具有某质荷比离子的数量。4、液相色谱-质谱联用仪的维护4.1仪器检定参考国家教育委员会“JJ（教委）003―1996有机质谱仪检定规程”进行检定。4.1.1技术要求（1）外观要求仪器应有规定标志；仪器各部件应完好无损，整个仪器系统的连接应正确无误。（2）安装条件仪器应置于平稳工作台上，仪器室应无剧烈震动，无有机蒸气及腐蚀性气体，附近无强电场和强磁场干扰，室内应有空气交换系统，通风良好，室温应在15C～25℃，相对湿度小于70%，仪器供电电压220V±10V,频率50Hz。4.1.2检定项目（1）真空系统（2）质量范围（3）质量稳定度及准确度（4）分辨率（5）全扫描MS/MS灵敏度（6）数据系统仪器控制软件4.1.3检定方法（1）检查仪器的安装是否符合要求，外观是否完整，联接是否有误。（2）真空度高真空铝发射真空计显示真空度达到10-5mmHg～10-7mmHg。4.1.3检定方法（3）质量范围及质量数检定配制一定浓度含有咖啡因、吗啡、高聚物UItramark1621等的校验储备液，安装电喷雾离子源(ESI)，采用流动泵进样，流速3μl/min，正离子检测校，收集累计质谱信号，并同其标准图谱进行对比，校准质量数。4.1.3检定方法（4）质量稳定度及准确度在50%异丙醇/50%水的溶剂中，配制浓度为0.1ng/ul利血平的溶液，采用流动泵进样，流速3μl/min，正离子检测模式，分别安装电喷雾离子源(ESI)和大气压化学电离离子源(APCI)，设定相应质谱条件，间隔2小时进样一次，共进样5次，收集累计质谱信号，并同其利血平标准分子离子峰（M+1=609.3）进行对比，达到质量稳定度±0.1amu/h。质量准确度±0.1amu。4.1.3检定方法（5）分辨率取质量范围及质量数检定项中校验储备液，安装电喷雾离子源(ESI)，采用流动泵进样，流速3μl/min，正离子检测模式，收集质谱信号，ZoomScan模式，考察质量范围m/z1822质谱信号，计算分辨率R＞2000。4.1.3检定方法（6）全扫描MS/MS灵敏度选用电喷雾离子源或大气压化学电离离子源，在电磁六通阀上安装2u1定量管，连接液相泵，设定质谱条件，正离子检测模式。取浓度为1pg/μl的利血平溶液进样2μl，选取50%异丙醇/50%水为流动相，流速350～400u1/min，质谱扫描范围165-615，选择全扫描MS/MS模式，优化碰撞能量，采集m/z为609准分子离子峰的二级碎片离子(195、397、448)信号，其信噪比最小为50：1。4.1.3检定方法（7）数据系统(包括计算机检索)检测仪器控制软件及其它相关软件各项功能能否正确使用。4.1.4检定结果处理和检定周期（1）经检定结果全部项目均符合技术要求者,