角膜移植质量控制标准doc-角膜移植质量控制标准

2019/8/221第五章实验动物质量监测遗传质量监测微生物学与寄生虫学监测饲料质量监控环境质量监测2019/8/222实验动物质量监测的意义生物学实验研究的四个基本条件Animal，Equipment，Information，Reagent，简称AEIR四要素这4个要素在整个实验研究中具有同等重要的地位，不能忽略或偏废。事实上，实验动物质量往往成为制约性要素，影响整个实验的质量和水平实验动物质量监测是实验动物科学的重要内容，是确保实验动物质量的必要手段。2019/8/223实验工作人员的健康和生命的保证常见的人畜共患病：流行性出血热、狂犬病、猴B病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、利什曼原虫等2019/8/224动物生产和繁殖的保证动物一旦染上传染病，则种群难以净化，一些烈性传染病如鼠痘、兔病毒性出血症等可致动物全军覆没，造成巨大经济损失。2019/8/225实验结果准确性、规律性、重复性的保证2019/8/226实验动物质量监测主要包括以下几个方面：遗传质量、微生物与寄生虫质量、饲料质量、环境质量监测。2019/8/227第一节遗传质量监测实验动物的遗传背景与反应特性，是影响实验结果的重要因素。不同遗传背景与反应特性的实验动物，对同一刺激有时可引起不同质和量的反应。为了保存实验动物品种品系特性。使实验动物使用者在动物实验中能得到正确的、可重复的科学数据，保证生物医学研究的良好效果，实验动物生产者在严格遵守品系繁育技术路线的同时，还必须努力做好实验动物遗传质量的严格监测，以防止实验动物遗传上的污染和变异。2019/8/228如：BALB/c对放射线比其他品系更为敏感。C57BL/6肿瘤发生率低，A系高。BALB/c和C3H小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性存在显著差异SHR为自发性高血压大鼠，心血管疾病发生率高2019/8/229一、群体管理管理上人为的粗心最易引起遗传上的混杂，所以对育种群进行恰当的管理是保证遗传质量的最有效方法。每一个实验动物育种机构都应当认真执行良好的育种制度，完善地保持育种记录，基础群应有系谱记录。而要做到以上要求，最重要的因素就是要有训练有素、经验丰富的技术人员，他们应懂得育种体系和方法、记录方法、动物遗传学、实验动物学等知识。2019/8/2210二、免疫学标记监测（一）皮肤移植法这是目前最常用和最灵敏的检测亚系内或亚系间组织相容性基因差异的方法。在小鼠和大鼠中普遍采用的是尾部或背部皮肤移植法。皮肤移植法灵敏度高。易掌握，经济。不需昂贵设备，易对植皮成活情况进行观察和判断。由于手术创伤小，动物对移植创伤的抵抗力强。所以不会影响检测结果。可检测出许多H基因。并能有效地测出新发生的、造成亚系变异的遗传混杂和突变。2019/8/2211（二）混合淋巴细胞反应混合淋巴细胞反应的原理为：异源动物或遗传上有差异个体的淋巴细胞混合或培养相当时间后，这些细胞都开始增大，合成DNA、RNA、蛋白质，甚至进一步裂解。这是植皮排斥反应辨别和扩增阶段的体内对应方法，其结果可预测体内植皮一宿主反应。此反应结果可在7～9天获得，定期地从群体中抽取足够量的动物进行监测能够维护实验动物的品质。2019/8/2212（三）淋巴组织移植用供体的均质淋巴器官，如骨髓、脾、淋巴结、胸腺或胚胎肝脏制备出单细胞悬液。然后将适量活细胞通过静脉或腹腔注射到受体动物体内，组织相容性由受体中存活者及脾增大者来确定，也可以用放射学方法。根据移植细胞的存活数测定。2019/8/2213三、生化标记监测通过多种形式的电泳和电聚集．可检定生化标记即同工酶或蛋白质，常用的电泳介质有乙酸纤维素膜、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。每一种标记系统都需要将缓冲液、温度、时间、电压和电流调整到最佳值．并做特异性染色，最后将得到的带型与公布的生化遗传图式进行比较。如中华人民共和国国家标准GB；T14923-2001公布9种常用近交系大鼠生化位点标记基因(表5-2)。2019/8/2214表5-2常用近交系大鼠生化位点标记基因StrainAkp1Cs2Es1Es3Es4Es6Es8Es9F344/NaaaababaLOU/CaaaabbbaSHRababaabaWKYbbadbaacLEW/MaaadbabcACIbababbba2019/8/2215四、骨骼形态特征监测常采用“下颌骨分析法”来鉴别和检测大小鼠的亚系变异。将年龄、性别、体重相当的大鼠或小鼠处死后，小心剪下头部，煮沸2～3min以上，加入蛋白水解酶，37℃恒温保持过夜，剔除残余肌肉，除去切齿，仔细分辨出右下颌骨，加以标记，在直角坐标系上测量出多个形态特征参考点距离。将所有测量的平均数作统计分析，利用判别函数确定下颌骨形状。如果测量值集中，则表明被测亚系间无显著的遗传变异。2019/8/2216五、染色体带型监测可以利用染色体分带技术，鉴别C带和Q带作为染色体标记，用来区分大、小鼠的近交系，在多数大、小鼠的近交系中，所有中期染色体都存在C带材料，同源染色体的C带区域大小相同；不同的近交系，C带材料大小不同，是品系特异的，是一种很有价值的检测亚系变异和混杂来源的方法。2019/8/2217六、现代分子生物学技术在遗传监测中的应用传统的遗传监测方法来源于过去研究者对哺乳动物进行遗传分析时采用的研究手段。随着分子生物学技术的发展，分子生物学技术有可能取代传统的遗传监测方法，其优点是多态性高，位点丰富，实验技术成熟，直接涉及生物的遗传基础，DNA样品容易保存和运输等等。现将在遗传监测中有着广泛应用前景的几种分子生物学方法介绍如下：2019/8/22181．限制性片断长度多态(RFLP)技术当动物基因组DNA被限制性内切酶消化时，酶能够识别双链DNA链上的特定核苷酸序列，并在每条DNA链上切割产生一个切口，将双链DNA分子断开而形成3`-OH和5`-P末端，使DNA裂解为片断。这些片断的长度在动物群体中存在变异，造成多态现象。通过DNA电泳和DNA探针分子杂交技术，即可观察到不同带型。2019/8/2219例如：位于小鼠第2号染色体补体-5（complement-5）位点(He)的pC5探针，当用HindⅢ消化小鼠DNA时，C3H品系将产生一条2.7kb的带型，而AKP品系将产生6.0kb和4.6kb两条带型。从而可以在He位点上区别这两个品系。目前所报道的RFLP位点已多达1098个，给遗传学研究带来许多便利条件。2019/8/22202．简单序列长度多态(SSLP)技术简单序列长度多态位点是动物基因内广泛存在的由l～4个核苷酸组成的成串的重复序列，又称为微卫星(microsatellite)。估计这样的DNA结构在哺乳动物基因组内的数目多达5万～10万个。目前在小鼠已发现有6000个之多。在每个特定的位点上，重复序列的长度在不同品系中存在着差异。采用夹在这些序列两端的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)和电泳，就能观察到这些位点的差异，从而区分不同的品系。2019/8/2221例如：小鼠第16条染色体的D16Mit4位点，其PCR产物的大小（bp）在常用近交系中分别如下：C57BL/6-132，DBA/2-123，A/J-147，C3H-123，BALB/c-149，AKR-126，CBA-132。SSLP测试技术比RFLP技术简便，多态性高，需要的DNA样品较少，引物容易获得，推广应用前景可观。2019/8/22223．DNA指纹(fingerprinting)技术上述两种DNA技术是针对单个DNA位点进行的测试。DNA指纹技术一次可同时测试多个位点，所以有一定的优势。DNA指纹技术经过电泳后可获得十几到几十条带，而这些带型在个体之间或品系之间有差异，如同人类的指纹在每个人都不同一样，因此而得名。通常有两种方法获得DNA指纹图。一是用限制性内切酶和小卫星探针技术获得的DNA指纹。二是用较短的随机扩增引物或小卫星引物，通过PCR而获得的DNA指纹。2019/8/2223DNA指纹图谱有时在亚系或亚群之间有区别，所以对亚系的监测十分有用。但是DNA指纹的结果因为电泳带太多而不好辨认和比较。因此，也影响其在遗传监测和其他研究中的应用。目前所做的DNA指纹比上述两种DNA技术少，但随着研究的深入和方法的改进，将来一定会有所突破。2019/8/22244．随机扩增多态（RAPD）技术RAPD技术是20世纪90年代发展起来的一种简便、快捷的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术。该项技术首先将动物目的基因组DNA提纯、酶切，用含10个碱基的随机引物，对DNA进行PCR扩增，经电泳，便可在多个位点上得到扩增产物。各种DNA多态分析方法，2019/8/2225如：DNA指纹、限制性片段长度多态(RFLP)等，虽然可直接检测基因组的遗传变异，但都不同程度地存在操作复杂、需要特异性操作、需要事先知道动物基因组DNA序列等不足。而RAPD技术，由于引物可任意改变，有可能找到任何一个个体特异的RAPD标记，从而为实验动物的遗传检测和分析提供一个十分有效的工具。2019/8/2226七、遗传性状监测结果的分析当被检查的遗传性状与每个品系的遗传概貌图一致时，同时遗传管理资料清晰、可信，可以认为有关品系的繁育生产正在正确地进行，该品系的动物遗传质量合格；若与遗传概貌图不一致时，可以考虑以下原因：2019/8/22271．遗传污染(geneticcontamination)这是最常见的遗传变异，往往是由于遗传学管理不善所致。另外，相同毛色的动物品系在同一个饲养单元中繁育、维持，非常容易产生品系间的错误交配。这种情况如发现得早，在被检查的性状中至少可以观察到一个以上基因标记发生改变，出现杂合型，或与遗传概貌不符的其他表型；如果发现得较迟，一些杂合基因可随机地固定为单一的纯合型，但与原品系的遗传概貌不一致。出现上述情况均应淘汰原品系，更换来源清楚、质量合格的动物作为新种，重新进行品系的繁育。2019/8/22282.遗传漂变(geneticdrift)遗传漂变是指一个品种或品系动物基因型在饲养的过程中可能发生随机的改变。这种改变多由于近交系动物部分杂合基因尚未纯合时即进行了分系，造成了亚系和支系的形成。监测时可以看到一个品系所有的动物在1～2个基因标记上与原品系的遗传概貌不符，但表型一致又均为纯合型。这种情况在经同系异体移植试验排除了遗传污染后需按照亚系和支系重新命名。2019/8/22293．遗传突变(mutation)遗传突变在哺乳类动物中的频率为10～5。在分析监测结果时，如果仅看到一只动物单个基因标记出现杂合型，应考虑有否发生遗传突变。为了证实此点，往往需要根据动物编号查询该只动物同窝兄妹或双亲的基因标记表型。如遗传突变发生在亲代，则同窝兄妹均应为杂合型或分离产生不同的表型。2019/8/2230如果在同窝兄妹或双亲中该基因标记的表型与遗传概貌图一致，应考虑被测个体发生了遗传突变。在检查时如同时发现其他基因标记的表型与遗传概貌图不符，无论是杂合型还是纯合型均应考虑发生了遗传污染，应立即淘汰换种。遗传突变如无特殊保留价值，在剔除突变的个体后，整个品系可以继续保存；如有保存价值，可将突变个体单独培育成同源突变近交系。2019/8/2231第二节微生物学与寄生虫学监测如何控制微生物和寄生虫，是实验动物标准化的主要内容之一。一般而言，科研中使用的实验动物，其微生物和寄生虫的控制级别越高，其结果就越精确、越可靠。2019/8/2232一、监测意义1．在人工饲养的开放环境中，实验动物被集中饲养，由于活动空间相对狭小，实验动物繁殖快、数量多，同时受到外界各种病原微生物以及寄生虫的干扰，极易导致疾病的爆发与流行。实验动物疾病的爆发，除造成动物死亡外，还会干扰实验的顺利进行，引起生物制品的污染，对人类健康产生危害。因此对实验动物进行微生物、病毒与寄生虫的监控，对保证实验研究的顺利进行和工作人员的身体健康具有十分重要的意义。2019/8/2233定期对各级实验动物群进行微生物学、寄生虫学监测，以确定各级实验动物是否符合原定级别，即是否有原级别不应有