生科第十三章-DNA的生物合成

第十三章DNA的生物合成DNAReplicationDNARNA蛋白质复制复制转录反转录翻译遗传信息传递的中心法则生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则(Centraldogma)。Reversetranscription一、DNA复制的概况（一）DNA半保留复制(semi-conservativereplication)子代分子DNA的一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。[实验证据]：1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的密度梯度离心实验。将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作Cscl密度梯度离心。密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果[14N-15N][14N]DNA[15N]DNA[14N-15N]复制子(replicon)：基因组中能独立进行复制的单位。复制起点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起点(origin)。在复制起点形成“复制叉”。原核：仅含一个。真核：多个起点，形成多个“泡”或“眼”。复制方向：一个起点一个叉，同方向合成两条链。一个起点2个叉，不同方向合成两条链。（二）DNA复制的起点与方向AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNADNA的双向和单向复制环状DNA复制时所形成的θ结构起点复制叉的推进复制叉起点起点起点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制多起点复制二、原核生物DNA的复制1.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymorase，PolⅠ）——1956年,Kornberg首先从大肠杆菌提取功能特点聚合作用：5`→3`，在引物的3′延伸。合成20个核苷酸即离开模板，填充空隙。3`→5`外切酶活性：校对功能5`→3`外切酶活性：引物切除、损伤修复（一）参与原核生物DNA复制的酶和蛋白主要功能：填补冈崎片段产生的空隙校对功能切除引物，DNA损伤的修复DNA聚合酶催化的链延长反应3´5´5´3´3´5´5´3´模板引物dNTPDNA聚合酶Mg2＋在5’-3’方向延伸大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能延长因子核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化2.PolⅡ和PolⅢpol：5’3’DNA合成3’5’外切酶活性，体内功能不清楚。polⅢ:主要负责DNA链的延伸。亚基作用：识别引物并使DNA母链与引物链结合。大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶活性5´-3´核酸外切酶活性活性DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++600120，000100++-30140，00010-20+++9000比较项目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修复复制功能（二）大肠杆菌DNA复制的起始DNA复制的不连续片段需要在引发体(primosome)作用下合成RNA引物。新DNA的一条链是按5´-3´方向（与复制叉移动的方向一致）连续合成的，这股链称为先导链（leadingstrand）。（三）DNA链的延伸（1）冈崎片段和半不连续复制DNA复制中的不连续片段（约1000-2000个核苷酸）称为冈崎片段(okazakifragment)。新DNA的一条链是按5´-3´方向（与复制叉移动的方向一致）连续合成的，这股链称为先导链（leadingstrand）。冈崎片段与半不连续复制另一股链的合成是不连续的，即先按5´-3´方向（与复制叉移动的方向一致）合成若干短片段（冈崎片段），再通过酶的作用将这些短片段连在一起构成第二条子链，称为后随链（laggingstrand）。先导链连续复制而后随链不连续复制，称为半不连续复制（semidiscontinuousreplication）。冈崎片段与半不连续复制DNA聚合酶在合成冈崎片段时，需要一个RNA短片断作为引物(primer)。具有3’端自由羟基（3’-OH）。引发体(primosome)：由引物合成酶和多种蛋白因子组成复合物。作用：合成RNA引物，沿后随链复制叉的行进方向移动，在不同部位，合成RNA引物。引物合成酶（primase）：以DNA为模板，自5’3’合成10-60核苷酸的RNA小片段。引物RNA上的核苷酸单位通过PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解除去。通过PolⅠ的聚合酶活性配上与模板互补的脱氧核苷酸。（2）冈崎片段的RNA引物（3）DNA连接酶（ligase）催化一条DNA链的3′-羟基与相邻的另一条DNA链的5′-磷酸根之间的磷酸二酯键的合成。使冈崎片段相互连接形成后随链。后随链的生成步骤：1.起始：RNA引物的合成2.延长：向引物RNA3′-端添加DNA顺序，合成短的DNA片段3.终止：RNA引物脱落并带以相应的DNA顺序，用共价键连接各DNA短片段连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链（4）母本DNA双链的分离DNA解链酶/DNA解螺旋酶（DNAhelicase）打断氢键，使复制叉前方的DNA双链解开。单链结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。旋转酶（gyrase）/拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ）兼具内切酶和连接酶活力，松弛DNA超螺旋，便于解链。（5）DNA聚合酶的“校对”作用DNA复制过程是一个高度精确的过程：起始时以RNA作为引物。DNA聚合酶的高度专一性（遵守严格的碱基配对规律）。DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）。DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配碱基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的移动方向旋转酶PolⅢ解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链后随链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´原核生物DNA聚合反应有关的酶类旋转酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物（1）DNA解链酶（DNAhelicase）（2）DNA旋转酶（gyrase）（3）单链结合蛋白（SSB）（4）引物合成酶（primase）（5）DNA聚合酶III（6）DNA聚合酶I（7）DNA连接酶（DNAligase）三、真核生物DNA的复制（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。（2）至少有5种DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶（Telomerase）催化复制。生物细胞DNA复制的特点：1、复制是半保留的。2、复制起始于细菌或病毒的特定位置，真核生物有多个起始点。3、复制可以朝一个方向，也可以向两个方向进行，后者更为常见。4、复制时，DNA的两条链都从5′端向3′端延伸。5、复制时半不连续的。四、逆转录作用(reversetranscription)——RNA指导下的DNA合成1970年Temin和Baltimore同时从致癌RNA病毒中发现逆转录酶。逆转录作用：以RNA为模板在反转录酶催化下，由dNTP聚合成互补DNA（cDNA）的作用，新生cDNA分子存有RNA基因组的信息。[体系]：RNA模板、反转录酶、引物、dNTP、Zn2+5’-3’方向聚合。进入细胞后放出病毒RNAcDNA整合进宿主染色体。利用反转录酶可制造任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的cDNA。反转录作用的意义：1、补充了中心法则。2、加深了对病毒致癌的认识。病毒致癌理论3、利用反转录酶，进行基因操作，制备cDNA。1、DNA复制需要：(1)DNA聚合酶Ⅲ；(2)解链蛋白；(3)DNA聚合酶Ⅰ；(4)DNA指导的RNA聚合酶；(5)DNA连接酶参加。其作用的顺序是：（）A、(4)(3)(1)(2)(5)B、(4)(2)(1)(3)(5)C、(2)(3)(4)(1)(5)D、(2)(4)(1)(3)(5)2、DNA上某段碱基顺序为5’-ACTAGTCAG-3’，转录后的上相应的碱基顺序为：（）A、5’-TGATCAGTC-3’B、5’-UGAUCAGUC-3’C、5’-CUGACUAGU-3’D、5’-CTGACTAGT-3’五、DNA的损伤与修复DNADamage(Mutation)andRepair损伤原因：物理因素（紫外线、各种辐射），形成嘧啶二聚体化学因素（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）UV遗传物质的改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。突变实质：DNA分子上碱基的改变。生物自身具有精确、严密的DNA损伤修复系统，对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。•光修复、切除修复、重组修复、SOS修复。1、直接修复光复活酶(photolyase)UV2.切除修复（excisionrepair）•内切酶在二聚体处切断单链DNA；•5′-核酸外切酶切除含嘧啶二聚体的寡核苷酸片段；•DNA聚合酶在断口处进行局部修复合成；•连接酶将新合成的DNA链与原DNA链连接在一起。3.应急反应修复和重组修复六、DNA重组与克隆基因重组——在体外将目标基因的DNA片段与载体连接形成重组体。DNA克隆——由单一DNA片段复制成许多相同DNA片段的过程。①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因⑦重组体的筛选DNA“克隆”过程本章重点半保留复制、半不连续复制、反转录、冈崎片段、多顺反子、单顺反子、前导链、后随链参与DNA复制的有关酶类和蛋白质及DNA的复制过程PCR（polymerasechainreaction）是一种体外核酸扩增技术，类似于天然DNA复制。靶DNA分子变性解链；在4种dNTP存在和合适和条件下，由DNA聚合酶酶促反应，由5’－3’扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板；经过30～50个循环，可使原DNA量扩增数百万倍。9.聚合酶链式反应（PCR）技术与DNA扩增（七）细菌的限制—修饰系统限制性核酸内切酶——能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶。如果识别序列中的碱基被修饰，限制酶将无法起作用。限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对称性。限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—GT—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—TG—5′粘性末端EcoRⅠ5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平头末端HpaⅠ.核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合真核生物DNA聚合酶α、β、γ及δ四种，都有5`→3`聚合功能。α及δ参与核DNA复制；α：链合成的引发，δ：链的延长polδ；切除引物后填补空隙β：外切核酸酶γ：线粒体DNA复制真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶分子量亚基数细胞内分