法医物证学考点

1法医物证学：是以法医物证为研究对象，以提供科学证据为目的，研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的一门学科。法医物证学是法医学的分支学科，其研究内容属于法医学中的物证检验部分，是法医学研究的主要内容之一。法医物证的特点：①法医物证的稳定性受环境条件的影响；②法医物证属于“科学证据”。法医物证学→生物检材→遗传标记→个人识别遗传（heredity）：生物繁衍过程中，子代与亲代相似的现象。变异（variation）：生物繁衍过程中，子代与亲代有所不同的现象。遗传标记（geneticmarker，GM）：个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时，这种遗传性状就称为遗传标记。遗传性状，即生理生化特征，可作为标志来识别携带它的个体、细胞和染色体。单位遗传性状是指可检测的、由遗传决定的、并能够以一定的规律从亲代传给下一代的形态学、生理学及分子生物学特征。DNA的变性和复性：某些理化因素（温度、PH、离子强度等）会导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，使双链DNA解离为单链，这种现象称为DNA变性。DNA变性只改变其二级结构，不改变它的核苷酸序列。当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构,这种现象称为复性（renaturation）。融链曲线的中点所示温度称作该DNA分子的融链温度（meltingtemperature，Tm），Tm是一半DNA分子变性时的温度。串联重复序列（tandemrepeats）：其结构形式是以相对恒定的短序列作为重复单位，首尾相接，串联连接形成。在人类基因组中，串联重复序列约占10%，主要分布在非编码区，少数分布于编码区。编码区中的重复DNA与功能有关，非编码区串联重复DNA多分布在间隔DNA或内含子。短串联重复序列（shorttandemrepeats，STR）：可变数目串联重复序列（variablenumberoftandemrepeats，VNTR）：假基因（pseudogene）：是基因组中丧失功能的基因，这类基因或是在复制扩增过程中因为突变失去了调控信号，不再具有转录功能；或丢失拼接加工信号，转录产物无法正确拼接形成成熟mRNA；或在编码区形成终止信号，产生不完整肽链。多基因家族（multigenefamily）：是指一组具有功能相似，碱基序列相同或部分同源的基因。转座子（transposon）：又称为可移动DNA成分，是指DNA分子内或分子间可以转移的DNA片段。除散布重复序列外，转座子还包括DNA形式转座子和拟反转录病毒反转录转座子元件。端粒（telomere）：线性形式基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，是一段DNA和蛋白质形成的复合结构，叫做端粒。DNA的甲基化修饰：生物体在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。甲基化修饰修饰限于CG序列中的胞嘧啶。基因突变的分类：生物体的基因组DNA并不稳定，经常会出现各种各样的可遗传的改变，在子代留下变异的遗传信息。在DNA分子水平，DNA损伤的后果之一就是突变（mutation）。主要分为编码区碱基突变和非编码区突变两种。①编码区碱基突变：碱基替代在基因组中是最常见的突变形式，分转换（transition）和颠换（transversion）两种。②非编码区突变：非编码区DNA没有表达产物，DNA复制中也能够出现碱基的错配、插入和2缺失，但是对细胞正常生理过程不构成实质性影响。无论在编码区或非编码区，突变的后果从没有效应到有害效应和有利效应，各种情况都会出现。碱基替换：碱基转换、碱基颠倒碱基序列改变基因突变碱基排列改变：倒位、易位碱基数目改变：插入、缺失、重复同义突变（samesensemutation）：是指DNA组成变了，但密码子没有改变，或密码子虽然不同，但编码产生同一种氨基酸，这种突变又称中性突变。错义突变（missencemutation）：是指DNA组成改变使编码一种氨基酸的密码子改变成编码另一种氨基酸的密码子。无义突变（nonsensemutation）：是指某一碱基的替换使氨基酸密码子变为终止密码，可过早地终止转录，形成无活性的肽链。移码突变（frameshiftmutation）：DNA链上插入或缺失一个或n个核苷酸，使下游密码子阅读框发生变化，导致在插入或缺失部位以后的编码发生相应改变。终止密码突变：是DNA分子中的某一终止密码突变为编码氨基酸的密码子，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。沉默突变（silentmutation）：仅改变表达产物的单个氨基酸，对蛋白质的生理功能没有影响的点突变，是形成蛋白质多态性的主要原因。DNA多态性（DNApolymorphisms）：基因水平上的多样性来自基因的突变，当基因突变以等位基因形式在群体中得以保留，并能够从亲代遗传给子代，可形成个体间的遗传差异。不同个体间的遗传差异形式是不同的等位基因组成。等位基因之间的差异可以是点突变引起的序列不同，也可以是因为碱基的插入或缺失引起的片段长度不同，都能构成具有个体特征的DNA遗传标记。DNA遗传标记可以出现在编码区，也可以存在于非编码区。在基因组DNA中，这种由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性。DNA长度多态性（DNAlengthpolymorphisms）：是指同一基因座上各等位基因之间的DNA片段长度差异构成的多态性。DNA长度多态性靶序列主要是指可变数目串联重复序列（VNTR），VNTR既存在于小卫星DNA中，也存在于微卫星DNA中。由于命名习惯和为了便于区分，通常小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称为VNTR，而把微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列（STR）。DNA序列多态性（sequencepolymorphisms）：是指一个基因座上，因不同个体DNA序列有一个或多个碱基的差异而构成的多态性。可以理解为该基因座上所有等位基因DNA长度相同，但是它们之间的序列存在差异。在基因组DNA中，无论是编码区或者非编码区，单碱基替换是最基础的突变形式。在人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%，就形成单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）。限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）：RFLP分析是一种传统的分子生物学检测技术，广泛应用于突变分析、基因诊断、基因定位等各个方面。法医物证鉴定应用RFLP技术主要是对人类基因组中的VNTR基因座进行分型，其技术核心是DNA分子杂交，决定RFLP分析图谱个体特异性的因素是限制性核酸内切酶的特异性和探针的特异性。检测所用的探针多是由人类基因组DNA中筛选出的小卫星序列，选择特异性不同的探针，在不同的杂交条件下，可以只检出单个VNTR基因座，也可同时检出多个VNTR基因座，前者称为DNA纹印，后者称之为DNA指纹，检测所用的相应探针3分别被称为单基因探针（single-locusprobe）和多基因探针(multi-locusprobe)。Southern印迹杂交：是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。Southern印迹杂交（Southernblot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。（琼脂糖凝胶电泳→硝酸纤维素膜吸印）。限制性内切酶常见的有那些？限制性内切酶（restrictionendonuclease）：一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。合成引物的要点，PCR的反应组成：标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5μlMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100μlPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：①模板DNA，②寡核苷酸引物，③dNTP，④反应缓冲液，⑤TaqDNA聚合酶。PCR基本原理：PCR技术是模拟生物体内DNA的半保留复制，在体外合成DNA链的方法，在模板、DNA、引物、dNTP、Taq酶存在的条件下经过：“高温变性→低温退火→中温延伸”三步循环，获得大量扩增片段。4合成引物的要点：引物合成是通过测定引物的OD值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。第一步，是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。常染色体STR与性染色体STR有什么不同？常染色体STR：短串联重复序列(STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列。它由2～6个碱基对构成核心序列,呈串联重复排列,其长度多态性主要由核心序列拷贝数目的变化而产生。一般认为,人类基因组平均每6～10kb就有1个STR基因座,为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。与限制性片段长度多态性产生的DNA指纹相比,用聚合酶链反应技术(PCR)扩增STR基因座产生的DNA纹印具有更高的灵敏度。STR扩增片段较短(100～300bp),对于常见含部分降解DNA的陈旧斑痕,PCR扩增STR比DNA指纹分析更容易成功。性染色体STR：人类Y染色体属于近端着丝粒染色体，由长臂Yq和微小的短臂Yp组成，DNA长度约60Mb。Y-DNA中大致有五类多态性遗传标记：卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA、插入或缺失及SNP。Y染色体STR基因座（Y-STR）是其中一种重要的遗传标记。与常染色