实验动物分组原则

药理学实验设计及基本技术从离体筛选到在体研究第6讲药理学实验设计•一、实验动物分组原则•(一)对照原则•1、空白对照组：为溶剂或赋形剂组，用于观察不给药（或不处理时）实验对象的反应和指标变化，其目的,一是作为病理模型制造是否成功，实验药物是否有效的比对标准；二是排除假阳性结果。•2、模型对照组：根据药效学研究的目的，制造相应的动物病理模型，并给予溶剂或赋形剂，用于观察具有病理变化的实验对象的反应和指标变化，作为实验药物是否有效的比对标准。•3、阳性对照组：采用药典上记载的或临床公认有效的药物作为阳性药，设置对照组，其目的，一是比较实验药物与临床目前使用药物间的药物效应强度；二是考察实验方法及技术的可靠性；三是排除假阴性结果。•（二）随机原则•随机是减小实验差异的最基本方法，通过随机的方法，将客观存在的各种差异对实验结果的影响降低到最小。药理学实验中，虽然可以通过各种方法控制实验条件，但仍然不可避免由于各种差异造成的影响，特别是在动物实验中，动物间的个体差异是无法排除的客观存在，可通过随机的方法，分配到各实验组中，使这种差异不至于影响实验结果。•在实验过程中实施随机原则，可根据具体实验特点，采用不同的随机方法，实现实验设计和实施过程的随机化。常用的随机分组方法主要有：•1、单纯随机分组法：又称完全随机•（1）、随机数字表法：•（2）、计算机随机数字法：•2、简化分层随机分组法：简化均衡随机•3、配对随机分组法：•4、区组随机分组法：•动物编号12345678910•随机数字04376088020324179781•组别ABAAABABBB•110120021•81/4=20…..1•将第2组的1号动物调到第3组•（三）重复原则•重复是保证实验结果可靠的重要措施之一，包括重现性和重复数。重现性指的是，在不同空间与时间条件下，按同样的实验方法和条件，可获得同样的实验结果，只有可重现的结果才是科学可靠的，不能重现的结果可能是偶然现象，没有科学价值；重复数指的是，实验要有足够的次数或例数。在实验中要求有一定的重复数，目的是消除个体差异和试验误差，提高实验结果的可靠性。一般，小动物（如小鼠、大鼠）每组10-30例；大动物（犬、猫、羊、猴）每组5-10例。•（四）单盲和双盲原则•为保证实验结果的可靠性、真实性和科学性，排除研究者或实验对象的主观偏因，实验设计中应依据单盲和双盲原则。单盲试验中，仅受试对象不知道所用的是实验药还是对照药；双盲试验中，受试者、研究者均不知道所用药物是实验药还是对照药，直至试验结束才作统计处理，可排除因主观偏差造成的假阴性或假阳性结论。•二、实验药物的给药方法•给药的途径、制剂、剂量•（1）如有的激素在肝脏内破坏，经口给药就会影响其效果。•（2）有些中药用粗制静脉注射，因其成分复杂，如含有钾离子，可以有降血压作用，若把这种非特异性降压作用解释为特殊性疗效就不恰当。这类实验结果如果用口服或由十二指肠给药就可鉴别出来。•（3）也有些中药成分在消化道破坏或不被吸收。如枳实中的升压有效成分，对羟福林和N-甲基酪胺只是在静脉注射时才有疗效。•（4）有些中药含有大量鞣质，体外试验有抗菌作用，但在体内不被消化道吸收，则没有抗菌作用。•（5）给药的次数对一些药物也有关系，如雌三醇与细胞核内物质结合的时间非常短，所以，每天一次给药的效果就比较弱，如将一天剂量分为八次给药，则效果将大大加强。•（6）药物的浓度和剂量也是一个重要问题，太高的浓度，太大的剂量都会得出错误的结果。如有用1/2LD50腹腔注射某药物后动物活动减少，认为该药有镇静作用，实际上1/2LD50的剂量已近中毒量，这时动物活动减少，不能认为是镇静的作用。•三、实验动物用药量的确定及计算方法•（一）动物给药量的确定•在观察一个药物的作用时，应该给动物多在的剂量是实验开始时应确定的一个重要问题。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能引起动物中毒致死，可以按下述方法确定剂量：••1．先用小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般可取1/10-1/5。••2．植物药粗制剂的剂量多按生药折算。••3．化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。••4．确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现（体重下降、精神不振、活动减少或其他症状），可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。••5．用大动物进行实验时，开始的剂量可采用给鼠类剂量的十五分之一～二分之一，以后可根据动物的反应调整剂量。••6．确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼小动物，剂量应减少。如以狗为例：6个月以上的狗给药量为1份时，3-6个月的给1/2份，45-89日1/4份，20-44日的给1/8份，10-19日的给1/16份。••7．确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同，以口服量为100时，灌肠量应为100-200，皮下注射量30-50，肌肉注射量为25-30，静脉注射量为25。常用实验动物的最大给药量和使用针头规格动物名称项目灌胃皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射小白鼠最大给药量使用针头1ml9(钝头)0.4ml5(1/2)0.4ml5(1/2)1ml5(1/2)0.8ml4大白鼠最大给药量使用针头1ml静脉切开针1ml60.4ml62ml64ml5鼠最大给药量使用针头3ml静脉切开针1ml6(1/2)0.5ml6(1/2)4ml75ml5兔最大给药量使用针头20ml10号导尿管2ml6(1/2)2ml6(1/2)5ml710ml6猫最大给药量使用针头20ml10号导尿管20ml72ml75ml710ml6蛙淋巴囊注射最大注射量1ml/只实验动物最大给药量•（二）实验动物用药量的计算方法•动物实验所用的药物剂量，一般按mg/kg体重或g/kg体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算出相当于每kg体重应注射的药液量（ml数），以便给药。•例1：计算给体重1.8kg的家兔，1g/kg静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉，应配成多少浓度的溶液合适？（5ml/kg)•（三）人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法•1．人与动物用药量换算人与动物对同一药物的耐受性是相差很大的。一般说来，动物的耐受性要比人大，也就是单位体重的用药理动物比人要大。人的各种药物的用量在很多书上可以查得，但动物用药量可查的书较少，而且动物用的药物种类远不如人用的那么多。因此，必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：人用药量为1，小白鼠、大白鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。•此外，可以采用人与动物的体表面积计算法来换算：•（1）人体体表面积计算法计算我国人的体表面积，一般认为许文生氏公式（中国生理学杂志12:327,1937）尚较适用，即：•体表面积（m2）=0.0061×身高（cm）+0.0128×体重(kg)-0.1529•例：某人身高168cm，体重55kg，试计算其体表面积。•解：0.061×168+0.0128×55.0.1529=1.576m2常见动物病理模型制备•一、按产生原因分类（一）自发性动物模型（SpontaneousAnimalModels）••是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病。包括突变系的遗传疾病和近交系的肿瘤疾病模型。突变系的遗传疾病很多，可分为代谢性疾病、分子疾病和特种蛋白质合成异常性疾病。如无胸腺裸鼠、肌肉萎缩症小鼠、肥胖症小鼠、癫痫大鼠、高血压大鼠、无脾小鼠和青光眼兔等。它们为生物医学研究提供了许多有价值的动物模型。近交系的肿瘤模型随实验动物种属、品系的不同，其肿瘤的发生类型和发病率有很大差异。•很多自发性动物模型在研究人类疾病时具有重要的价值，如自发性高血压大鼠，中国地鼠的自发性真性糖尿病，小鼠的各种自发性肿瘤，山羊的家族性甲状腺肿等。利用这类动物疾病模型来研究人类疾病的最大优点，就是疾病的发生、发展与人类相应的疾病很相似，均是在自然条件下发生的疾病，其应用价值就很高，但是这类模型来源较困难，不可能大量应用。由于诱发模型和自然产生的疾病模型是有一定差异的，如诱发的肿瘤和自发的肿瘤对药物的敏感性是不相同的，加之有些人类的疾病至今尚不能用人工的方法在动物身上诱发出来，因此，近年来十分重视对自发的动物疾病模型的开发，有的学者甚至对狗、猫的疾病进行大规模的普查，以发现自发性疾病的病例，然后通过遗传育种，将这种自发性疾病模型保持下来，并培育成具有特定遗传性状的突变系，以供研究。近年来许多动物遗传病的模型就是通过这样的方法建立的。在这方面小鼠和大鼠的各种自发性疾病模型开发和应用得最多。这类模型在遗传病、代谢病、免疫缺陷病、内分泌疾病和肿瘤等方面的应用正日益增多。•（二）诱发性或实验性动物模型（ExperimentalAnimalModels）••实验性动物模型是指研究者通过使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒使动物患相应的传染病，又如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。诱发性疾病动物模型具有能在短时间内复制出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要等特点，因而为近代医学研究所常用，特别是药物筛选研究工作所首选。但诱发模型和自然产生的疾病模型在某些方面毕竟存在一定差异。因此在设计诱发性动物模型要尽量克服其不足，发挥其特点。••1982年，Hegreberg与Leathers发表了一部两卷的动物模型目录，第1卷“自发性动物疾病模型”包括了1298篇文献，第2卷“诱发性动物疾病模型”包括了2707篇文献。国内施新猷主编“医学动物实验方法”（人民卫生出版社，1980年）、郭鹞编“人类疾病的动物模型”第1辑，（人民卫生出版社，1982年），可供参考。另外也可在一些药理实验方法学专著中找到，特别是那些容易复制、已经成为定型的（或所谓经典的）模型、可供筛选药物之用的动物模型，这类书中均有介绍。疾病动物模型的复制方法还可在美国《医学索引》（IndexMedicus）中的“动物疾病模型”（DiseaseModel,Animal）主题之下找到。•二、肿瘤模型的复制方法•（一）诱发性肿瘤动物模型••1．肝癌二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌：混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。•2．胃癌甲基胆蒽诱发小鼠胃癌：取20g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内，在酒精灯上微微加温，使MC液化渗入线结。MC浓度为0.05～0.1g20-甲基胆蒽内浸入10～20根线。手术埋线后4～8个月可诱发成功胃癌。用不对称亚硝胺，剂量为0.25ml/kg体重，3个月后全部动物发生前胃乳头状癌，7～8个月后有85～100%发生前胃癌。昆明种最敏感。用甲基亚硝基醋酸尿素给BD大鼠饮水中加2mg/kg体重，每周5次饮用，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。•3．食管癌甲基苄基亚硝胺（MBNA）诱发大鼠食管癌：取体重100g以上的Wistar大鼠，任其食用含甲基苄基亚硝胺的饮水，并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75～1.5mg/kg体重。80～100天可诱发成食管癌，发生率为53%。••4．肺癌二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌：小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次剂量56mg/kg，DEN总剂量达到868mg，观察时间为100天左右时，发癌率可达40%。而DEN总剂量达到1176mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。乌拉坦诱发肺腺癌：小鼠（A