细胞程序性死亡相关信号通路关键蛋白和研究策略

©2015CellSignalingTechnology,Inc.细胞程序性死亡相关信号通路关键蛋白和研究策略凋亡／自噬／细胞程序性坏死／细胞焦亡李振亚博士CST中国公司细胞死亡的多种形式2©2015CellSignalingTechnology,Inc.细胞死亡的多种形式3©2015CellSignalingTechnology,Inc.细胞程序性死亡的多种形式NatureReviewsGastroenterology&Hepatology10,627-636(November2013)4©2015CellSignalingTechnology,Inc.程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)，是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。它既出现在个体正常的发育过程中，也出现在非正常生理状态或疾病中；既在体内发生，也发生在体外培养物中。凋亡、自噬、细胞程序性坏死、细胞焦亡都是是程序性死亡的表现形式讲座内容§细胞程序性死亡的主要形式和启动因素§凋亡相关信号通路关键节点、检测方法和CST特色产品§自噬相关信号通路关键节点、检测方法和CST特色产品§新型细胞程序性死亡（细胞程序性坏死和细胞焦亡）相关信号通路关键节点、检测方法和CST特色产品©2015CellSignalingTechnology,Inc.5凋亡相关信号通路关键节点、检测方法和CST特色产品©2015CellSignalingTechnology,Inc.6凋亡的主要过程外源性凋亡：死亡受体途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.7内质网压力途径线粒体途径内源性凋亡凋亡的分支信号通路-死亡受体途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.8关键蛋白：①FADD②RIP1③RIP3④Caspase8程序性坏死是在正常凋亡途径受到抑制的情况下，由RIP1和RIP3形成复合体后，启动的一系列级联过程。凋亡的分支信号通路-线粒体途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.9关键蛋白：A.促凋亡因子：①Bid②Bim③Bad④Bak⑤Bax⑥Puma⑦NoxaB.抑制凋亡因子①Bcl-2②Bcl-XL③Mcl-1凋亡的分支信号通路©2015CellSignalingTechnology,Inc.10关键蛋白：A.Bcl-2家族成员①Bcl-2②Bcl-XL③Mcl-1B.IAP成员①cIAP②XIAP③FLIP④A20C.HSP家族成员①HSP27②HSP70③HSP90凋亡的形态学变化形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，①线粒体膜电位消失②通透性改变③释放细胞色素C到胞浆④核质浓缩，核膜核仁破碎⑤DNA降解成为约180bp-200bp片段胞膜有小泡状形成，⑥膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面⑦胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬，这与细胞坏死有显著区别。©2015CellSignalingTechnology,Inc.11凋亡常见观察和检测方法§免疫荧光（或免疫组化）法：①线粒体IMS蛋白的释放：如AIF，细胞色素c，分别用抗体染色，观察其分布变化。②Caspase3染色：用抗体染色，观察其分布变化。§WB检测：①检测Caspase3的活化前后条带的变化，确定是否发生剪切及程度。②其他多种信号通路关键分子的分析（见后）§形态学检测：DAPI（蓝色）、Hoechst33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexinV。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。§酶学检测：TUNEL染色法§流式检测：1）光散射法；2）细胞DNA含量的测定；3）Y啶橙染色法(AcridineOrange,AO)；4)若丹明(Rh123)染色法;5)原位末端标记技术;6)AnnexinV/PI法:在检测时有4个亚群包括机械性损伤细胞(Annexin-/P1+)、正常细胞(An2nexin-/PI-)、凋亡细胞(Annexin+/PI-)和继发性坏死细胞(Annexin+/PI+)被区分§其他凋亡相关因素分析§1）△ψmdissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。§2）细胞内氧化还原状态改变的检测：通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化§3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidiumbromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonylacridineorange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。©2015CellSignalingTechnology,Inc.12凋亡的分支信号通路-死亡受体信号通路©2015CellSignalingTechnology,Inc.13常用产品组合1：Caspase-8测定蛋白热卖产品Caspase-8人：#9496；#9746；#9748；小鼠：#8592；#4927;#9429;Caspase-3#9661；#9664；#9662；#9665Caspase-7#8348;#9491;#12827;#9492PARP#9532（多种属）；#5625(人)；9548（小鼠）简化信号级联1：Caspase-3Caspase-7PARP凋亡的分支信号通路-程序性坏死信号通路©2015CellSignalingTechnology,Inc.14常用产品组合2：测定蛋白热卖产品RIP1磷酸化RIP1：#65746（人）；#31122（小鼠）总RIP1：#3493（人）；RIP3总RIP3：#13526（人）；#95702（小鼠）；#15828（小鼠，大鼠）MLKL磷酸化MLKL：#91689（人）；#62233（小鼠）；总MLKL：#14993（人）；#28640（小鼠）；#37705（小鼠）；简化信号级联2：MLKLRIP1RIP3程序性坏死凋亡的分支信号通路-内质网应激关联的凋亡途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.15常用产品组合：测定蛋白热卖产品Calpain1#2556（多种属）Calpain2#2539（多种属）Caspase-12#2202（小鼠）;Caspase-9人：#20750；#7237；#9508；#9502小鼠：#9504；#9509；#9508大鼠：#9507；#9508Caspase-3#9661；#9664；#9662；#9665Caspase-6#9761；#9762Caspase-7#8348;#9491;#12827;#9492简化信号级联：Caspase-6Caspase-3Caspase-7Caspase-9Caspase-12内质网应激备注：此组合常常用于内质网应激引发的凋亡途径Calpain1Calpain2凋亡的分支信号通路-线粒体关联的凋亡途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.16常用产品组合1：测定蛋白热卖产品Caspase-8人：#9496；#9746；#9748；小鼠：#8592；#4927;#9429;Bid总Bid：#2002（人）;#8762（人）；#2003（小鼠）Bak总Bak：#12105（多种属）;#6947（人）;Bax总Bax：#2772（多种属）；#2774（人）；#5023（人）；#14796（小鼠，大鼠）CytoC#11940；#12963；#4272；#4280；Caspase-9人：#20750；#7237；#9508；#9502小鼠：#9504；#9509；#9508大鼠：#9507；#9508Caspase-3#9661；#9664；#9662；#9665Caspase-6#9761；#9762Caspase-7#8348;#9491;#12827;#9492简化信号级联1：CytoCCaspase-6Caspase-3Caspase-7Caspase-9BakBidBaxCaspase-8备注：此组合常常用于死亡受体引发的线粒体关联的凋亡途径凋亡的分支信号通路-线粒体关联的凋亡途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.17常用产品组合2：JNK测定蛋白热卖产品JNK磷酸化JNK：#9255；#4668；#9251总JNK：#9252；Bcl-2磷酸化Bcl-2：#2827（人）；总Bcl-2：#15071（人）；#4223（人）；#2872（人）；#3498（小鼠）Bim总Bim：#2933;#2819;Bax总Bax：#2772（多种属）；#2774（人）；#5023（人）；#14796（小鼠，大鼠）Bad总Bad：#9292；#9239；#9268；CytoC#11940；#12963；#4272；#4280；Caspase-9人：#20750；#7237；#9508；#9502小鼠：#9504；#9509；#9508大鼠：#9507；#9508Caspase-3#9661；#9664；#9662；#9665Caspase-6#9761；#9762Caspase-7#8348;#9491;#12827;#9492简化信号级联2：CytoCCaspase-6Caspase-3Caspase-7Caspase-9BimBaxBCL2Bad备注：此组合常常用于多种应激引发的线粒体关联的凋亡途径凋亡的分支信号通路-线粒体关联的凋亡途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.18常用产品组合3：ATM测定蛋白热卖产品ATM磷酸化ATM：#5883(人);总ATM：#2873（人，小鼠）；p53磷酸化p53：#9284（人）；12571（小鼠，大鼠）；总p53：#2524（多种属）；#2527（人）；#48818（人）；#32532（小鼠，大鼠）；Puma#12450（人）；#4976（人）；#24633（小鼠，大鼠）；#14570（小鼠，大鼠）；Noxa#14766（人）；CytoC#11940；#12963；#4272；#4280；Caspase-9人：#20750；#7237；#9508；#9502小鼠：#9504；#9509；#9508大鼠：#9507；#9508Caspase-3#9661；#9664；#9662；#9665Caspase-6#9761；#9762Caspase-7#8348;#9491;#12827;#9492简化信号级联3：CytoCCaspase-6Caspase-3Caspase-7Caspase-9Pumap53Noxa备注：此组合常常用于DNA损伤引发的线粒体关联的凋亡途径凋亡的分支信号通路-线粒体关联的凋亡途径©2015CellSignalingTechnology,Inc.19常用产品组合4：测定蛋白热卖产品Caspase-2#2224（人）;Bax总Bax：#2772（多种属）；#2774（人）；#5023（人）；#14796（小鼠，大鼠）CytoC#11940；#12963；#4272；#428