RNA干扰技术

RNA干扰技术RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。它是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过RNA调控基因表达的机制。最早的RNA干扰研究是从植物和线虫开始，2001年Tuchl等首次应用长度约为19~23个碱基对的双链小分子干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象，证实这些细胞也普遍存在RNA干扰的机制，从而在世界范围内掀起了研究和应用RNA干扰技术的热潮。RNA干扰之所以能引起生物医学界几乎所有研究领域的广泛性趣，是因为siRNA具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。与抑制基因表达的传统工具，如反义寡核苷酸和核酶等比较，siRNA沉默基因的效率高达数十到数千倍，是逆基因工具的革命性改进。此外与目标基因信使RNA相差一个碱基序列的siRNA的基因沉默效应大大受到削弱，从而保证了抑制目标基因的高度特异性。因此，siRNA的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘密的进程。siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，siRNA技术连续多年被美国《Science》杂志评选的“全球年度十大科学突破”。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域。第一节RNA干扰的研究历程虽然RNA干扰是一种古老的机制，但是第一篇报道这种现象的论文是在1990年发表的。1990年，Napoli和VanderKrol等在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象（cosuppression）。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的35S启动子，连入农杆菌的T-DNA质粒，在矮牵牛花中过度表达。她原先预期，查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色，但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色，内源性的查尔酮遭到沉默。Napoli教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。1998年，AndrewJ.Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制现象。他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后ACC氧化酶基因的mRNA和成熟mRNA。实验结果表明，外源重组基因片段能成功转录，但是mRNA成功转录后，因为某种原因发生了转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）。因此，AndrewJ.Hamilton认为内源性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。1995年，Guo等发现注射正义RNA（senseRNA）和反义RNA（antisenseRNA）均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫（C.elegans）par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire和Mello课题组接手了此课题。他们以秀丽新小杆线虫为模型，发现在Guo的课题中，引发线虫par-1基因沉默的是小片段的双链RNA，而不是正义单链RNA或负义单链RNA。他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的unc-22基因，进一步阐述了双链RNA在基因沉默中的作用，并将这一现象命名为“RNA干扰”。他们的研究成果激起了其他科学家研究RNA干扰现象的浓厚兴趣，由于他们的发现揭示了分子生物学中一个全新的，具有普遍性的机制，AndrewFire,CraigC.Mello两位科学家因此在2006年获得诺贝尔奖。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNA干扰在不同物种的表现形式。RNA干扰实验a：植物叶片；b：秀丽新小杆线虫；c：小鼠卵母细胞；d：果蝇复眼。1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的siRNA引发RNAi。同年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependentproteinkinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase，2',5'-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。第二节RNA干扰原理病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA（图1）。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA。研究表明在生物体中siRNA具相似的结构特征：为长约21～23bp的双链RNA，具5’单磷酸和3’羟基末端，互补双链的3’端均有一个2～3nt的单链突出。负责将dsRNA转化为siRNA的Dicer核酸酶，属于RNaseⅢ家族，具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi／Argonaute／Zwille)结构域，Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现，其催化结构域在dsRNA上反平行排列，形成四个活性位点，但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性，这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA，各种生物体内Dicer结构略有不同，致使siRNA长度存在微小差别。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，导致特定基因沉默，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。在RISC中，起靶序列识别作用的是siRNA的反义链，Zamore等发现在RNAi过程中，首先产生的是RISC无活性前体，分子量250kD，当加入ATP后可形成100kD的活性复合体。由无活性前体向活性酶复合物的转换类似蛋白酶原的激活，但RISC酶复合物激活不需要共价键断裂，而要求结合于其上的siRNA双链的解开。在ATP存在时，依赖于ATP的解旋酶解开siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换，mRNA取代正义链与反义链互补，然后由活化的RISC在互补区的中间，距离siRNA反义链3’末端约12bp处切断靶mRNA序列。图1RNAi机制siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，经过若干次的合成-切割循环，RNAi的作用不断放大，最终将靶mRNA完全降解。此外许多研究还显示RNAi信号可以越过胞间屏障向其他细胞和组织扩散，在植物中，RNAi信号可以通过两种途径在细胞间传递：①短距离的相邻细胞之间的传递，植物细胞之间有着非常丰富的连接——胞间连丝，沉默信号(如siRNA分子)可以通过胞间连丝在细胞间传递；②沉默信号还可以通过植物里纵横交错的脉管系统进行长距离的传送。而在动物中，RNAi信号的扩散需要特殊的蛋白参与，Hunter等在线虫中鉴定出了一种与沉默信号传播相关的蛋白，它是由SID一1基因编码的一种跨膜蛋白，能在膜上形成跨膜通道供沉默信号通过，SID-1蛋白同源物在果蝇中不存在，但有研究表明在哺乳动物中存在SID-1蛋白同源物。RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉默。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。一、线虫中的RNA干扰模型Tabara教授于1999年以秀丽新小杆线虫为模型（图2），揭示了RNA干扰的原理。线虫细胞上的跨膜蛋白SID-1引导细胞外的长链双链RNA进入细胞质，RNA立即与细胞质内的RDE-4，RDE-1蛋白形成复合体。然后DCR-1与DRH-1蛋白与该复合体结合，DCR-1蛋白将长链RNA切断，得到RDE-1结合的siRNA复合物。RDE-1-si-RNA复合物在解旋酶的作用下解链，RDE-1蛋白脱去，RISC酶与正义链和反义链中的一条链结合，RISC-单链RNA复合物在引导下与靶mRNA结合。反义RNA与靶mRNA上同源的部分特异性结合，在RISC的作用下，靶mRNA链被切断，无法与核糖体结合，翻译成蛋白质，引起基因沉默。同时，以反义RNA为引物，以mRNA为模板，在RdRP的作用下，生成新的siRNA反义链。这就是siRNA的级联放大的机制。RNA干扰现象介导的mRNA降解特异性强，同时由于放大机制的存在微量siRNA就能引起明显的RNA干扰现象。线虫中的RNA干扰机制比较典型，但是在高等生物中，RNA的机制又有细微差别。图2线虫中RNAi模型二、高等植物细胞中的RNA干扰机制植物细胞中在细胞核内产生的内源性miRNA（微小干扰RNA）参与了植物的基因表达的调控。植物miRNA多数长21个碱基，具有保守性，它的产生，是由miRNA前体长链dsRNA经Dicer酶家族（与DCR-1类似，常被称为DCL1、DCL2等）切割产生。以下机制为高等植物所特有：1、干扰机制依赖于Ago蛋白家族，该家族有10个成员，它们在siRNA积累，DNA甲基化作用中起着关键作用，在整个RNA干扰的转录后基因沉默（PTGS）机制中起调节作用。2、Dicer酶家族在高等植物中有特异性，共4个成员，称之为DCL1~DCL4它们与miRNA的成熟有关。同时，miRNA的成熟需要植物细胞特有的HYL1这种双链RNA结合蛋白的参与。3、植物中特有的RDRs（RNA依赖的RNA多聚酶），它的作用机制与昆虫，哺乳动物有明显差异。三、哺乳动物的RNA干扰机制哺乳动物的RNA干扰机制与高等植物稍有不同，主要表现在以下几方面：1、动物miRNA的长度多为22~24个碱基，比植物的长。2、动