ITC introduce(等温滴定量热)

ITCIntroduce（IsothermalTitrationCalorimetry）IsothermalTitrationCalorimetry等温滴定量热ITC：测定分子相互作用的方法在一次实验中，ITC可以测定：结合的亲和力常数（K）；结合反应中的焓变和熵变（ΔH、ΔS）；结合位点数（n）实验也可以测定有多个结合位点的样品等温滴定量热仪(ITC)神奇的微量热控制—功率补偿IsothermalTitrationCalorimetry实验流程1)样品池中加入待测大分子；2)参照池中加入缓冲液；3)将待测配体吸入注射器中；4)注射器置于样品池中；5)调整温度、搅拌速度和每次注射体积。典型的ITC数据上半部分表示每次注射采集的数据；下半部分表示每次注射的释放的热量；（上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图ITC理论基础∆G=-RTlnKB∆G=∆H–T∆S令人郁闷的公式说明了什么？1.相同的KD有着相同的∆G；2.相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。引发焓变和熵变的主要因素Enthalpy(-∆H)焓变Hydrogenbonds氢键Ionicinteractions离子作用特异性结合Entropy(+∆S)熵变Hydrophobicinteractions疏水作用Conformationalfreedom构象自由度非特异性结合ITC技术的应用领域分子相互作用：溶液中的几乎所有天然状态分子：包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、脂类、金属离子、小分子等等；工艺过程的开发和控制酶动力学药物研发非生物系统抗生素抗性的菌种为什么能更好的消灭抗生素DNA形成了三螺旋？药物结合的热动力学特征一样的亲合力，不一样的微观世界HIV蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼”ITC在小分子药物结构方面的优化抗疟疾新药就这样放弃吗？Kd=76nM∆H=-6.0kcal/mol∆∆H=-4.8kcal/mol-T∆∆S=5.7kcal/molKd=0.5nM∆H=-5.5kcal/mol∆∆H=-4.3kcal/mol-T∆∆S=2.2kcal/mol酶反应动力学的研究传统酶分析法的局限性（连续分析法，不连续分析法，偶合分析法）1.溶剂不透明或有混浊并对光谱检测有干扰；2.天然的、重组的或突变的酶活性低于分析方法的检测限；3.产物或底物没有光谱基团或荧光基团，或者标记的成本太高或太耗时；4.不连续分析要求多步进行；5.不存在直接的偶合反应；6.偶合分析不精确；7.底物或酶活性不清楚；8.蛋白质功能不清楚。ITC的优点1.方法开发简单；2.只要反应过程中有热量变化，ITC即可作为普适的方法；3.是一项灵敏的技术-噪音水平0.01μcal/sec，利用现在的先进仪器可以获得很高的信噪比；4.无需带荧光或光谱特征的底物参与反应；5.单次实验即可获得数据；6.适用于研究多种类型的酶;7.可以用于不透明的样品;8.所得数据可以与其它方法进行比较；9.除了获得热力学数据外还可以获得动力学数据。酶反应动力学的研究(不一般的ITC曲线）酶反应动力学应用ITCApplicationsEnzymeKineticsTypicalconcentrations•Enzyme25-100pM•Substrate10-100μM(2-20μlperinjection;15-30injections)Thanks!