74生物膜动态变化的分子机理与功能研究

项目名称：生物膜动态变化的分子机理与功能研究首席科学家：陈晔光清华大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容1.关键科学问题本项目将重点围绕生物膜动态变化这一膜生物学研究的国际前沿领域，系统地开展生物膜动态变化分子机制的研究，并重点揭示生物膜动态变化在细胞信号转导、能量代谢、增殖分化、物质运输和循环利用等关键生命活动中的重要作用：（1）生物膜动态变化的分子机理细胞生命活动得以实现依赖于生物膜体系的动态特征：物质动态交换及自身的更新与重构。细胞内各种生物膜体系始终处于不断的形成、消失及重建过程之中。本项目将研究生物膜动态变化的分子机理，寻找调控其变化的关键蛋白质分子，研究蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与膜脂之间相互作用关系，从细胞质膜、细胞器膜、核膜、细胞囊泡膜等方面阐明生物膜变化的分子机理。（2）生物膜动态变化在细胞生命活动中的作用生物膜在生命活动中承担着重要的作用，其动态变化过程将广泛地影响着细胞的各种功能。本项目将探索细胞囊泡膜与物质运输之间的关系、生物膜动态变化对信号转导的影响、核膜的动态变化对细胞增殖的影响、细胞器膜与能量代谢的关系以及生物膜与物质及细胞器的回收利用等相关膜生物学重点问题。2．主要研究内容：（1）生物膜转运及其调控机制的研究致密核心囊泡是神经肽和激素转运的主要承担者，对其转运过程机制和调控的研究，相对于突触囊泡来言要少得多。我们将集中力量，主要研究以下方面的内容：I.通过对一种高度保守定位于高尔基体的膜蛋白的研究来探索致密核心囊泡囊泡生成（biogenesis）和成熟（maturation）机制；II.锚定和激活是囊泡融合前的关键步骤，转运囊泡与靶膜（包括细胞质膜和各细胞器膜）的特异性锚定是决定囊泡融合的时间、空间特异性和囊泡融合速率的重要因子，对其分子机制和调控的认识还远未清楚。我们将选择多种Rab蛋白及它们下游效应物蛋白，研究它们在囊泡锚定中的作用、作用机制及其这些分子的相互作用网络；III.从半融合（hemi-fusion）机制、决定囊泡膜融合的SNARE复合物解聚合和各SNARE蛋白的循环利用等方面展开，对溶酶体膜不稳定的分子机理进行研究。（2）生物膜形态发生及维持的分子机制我们将以内质网网膜的形态为侧重点，深入研究膜蛋白在塑造生物膜形态中的作用。具体包括：a).对有曲膜功能的成管膜蛋白的结构与功能进行探究。酵母细胞的成管膜蛋白Yop1p和Rtn1p，虽然能被大量提纯，但是很难被结晶，所以用X光衍射的方法解析其结构不可行。我们将从Yop1p蛋白入手，在不同位点引入半胱氨酸，通过二硫键的形成与否，来判断氨基酸的侧链是否邻近，从而来推测这些膜蛋白的大致构象，如穿膜螺旋的排列方式等。b).高等动物中的Atlastin-1蛋白及其酵母中的Seylp都是Dynamin家族中的嵌膜GTP酶，我们推测其可能参与内质网管状网络的形成，因此将对Dynamin家族嵌膜GTP酶影响膜形态的机制进行研究。（3）生物膜组成成分的动态变化分析通过技术集成和条件优化建立由高分辨质谱、多维毛细管液相色谱、稳定同位素标记（如SILAC和iTRAQ等)和无标记等组成的，能够适合不同复杂程度的生物样品（如组织样本、细胞样本）的定量（膜）蛋白质组学技术平台。同时主要以生物膜和线粒体为样本，探索具有多次跨膜即高度疏水的膜蛋白和低丰度的膜蛋白质谱鉴定方法，提高膜蛋白的鉴定率。另外，我们将开展不同生理状态或生理过程（如发育、细胞分化）和不同病理状态下，生物膜动态变化过程中，主要膜蛋白、亚细胞器蛋白质组的表达水平的及其翻译后修饰的动态变化规律分析研究。开展II糖尿病发病机制的相关膜蛋白研究及肿瘤相关重要膜蛋白或抗原的研究。（4）生物膜的动态循环与自吞噬调控自吞噬在很多不同的细胞器的产生、消失和再生之间起着重要的作用。我们最近发现在吞噬溶酶体形成之后，溶酶体的膜成分可以通过在吞噬溶酶体上形成一个管状结构而得以回收利用，最后形成新的溶酶体，并发现这一过程受到mTOR激酶的调控。我们将系统、深入地对这一过程的分子机理进行研究，主要包括：筛选出调控自吞噬性溶酶体再生的新基因并研究其调控作用；用数学建模和系统生物学的方法探讨mTOR激酶、自吞噬及自吞噬降解产物的相互作用，阐释自吞噬的自我调控过程。最新的研究结果表明，损伤了的线粒体会被自吞噬体特异性的识别并降解。（5）核膜的动态变化与细胞增殖调控细胞核内外通过核孔复合体进行着广泛的物质信息交流。这种交流对细胞基因的表达直至整个细胞生命活动均起着重要的调控作用。高等生物的核膜在细胞周期中还呈现解聚和重新装配等动态变化。因此，我们将主要研究：Ran，nucleoplasmin和importin-β与核膜和核孔复合体的装配的关系；LBR（LaminBReceptor）、核纤蛋白及其结合蛋白与核膜动态变化的关系；细胞核动态结构与功能调控；核膜动态变化、核膜物质运输与细胞增殖调控。（6）生物膜动态变化对信号转导的调控我们将重点围绕生物膜动态变化对细胞TGFβ和Wnt信号通路的调控。具体的问题包括：TGFβ信号通路受体及其他下游分子在细胞膜上的分布及其调控机制；脂筏在TGFβ信号转导特异性决定中的作用；受体内吞以及进一步在细胞内分选的分子机理；脂筏动态及囊泡内吞对各条通路信号输出的影响；细胞自吞噬对Wnt及TGFβ信号转导通路的影响；研究有关囊泡融合的分子机制等。膜融合对生物膜动态变化起着至关重要的作用，并参与调控多种复杂的生物学过程。不同类型生物膜之间融合的过程具有一定的共性，又有其各自的特点。因此，我们将以六个课题组的科研实力为依托，从不同的角度对本研究内容进行联合攻关。具体的问题包括：鉴定囊泡融合过程中关键蛋白的功能；探索吞噬溶体膜与溶酶体膜、质膜与肌质网膜、细胞核重组过程中核膜融合的机制；研究胞外信号与生物膜融合过程的相互影响。二、预期目标1、本项目的总体目标：本项目以开展膜生物学国际前沿研究为目标，围绕膜生物学研究中关键的科学问题生物膜动态变化的分子机理，聚焦于生物膜动态变化在细胞信号转导、能量代谢、增殖分化、物质运输和循环利用等关键生命活动中的重要作用，结合膜蛋白质组学，细胞器和膜蛋白离体重组等关键技术，系统地开展生物膜和膜蛋白领域的国际前沿基础研究。本项目将建立和培养一支具有国际领先水平的膜生物学研究队伍，在瞄准重大科学问题和世界前沿领域的基础上，密切结合我国的实际情况，争取进一步开创和完善我国膜生物学的实验研究体系，并基于多种模式生物建立一定规模的膜蛋白功能研究的平台，在生物膜的动态变化的分子机制与功能研究上取得若干突破。本项目将大大提升我国膜生物学研究的水平和国际影响力，使我国该领域在国际上占据重要的地位，并为我国基于膜蛋白药物靶点的创新药物研发奠定基础。2、五年预期目标：（1）阐明致密核心囊泡运输过程中一系列膜动态的分子机制，探索包括内质网在内的细胞内膜精细结构形成和维持的关键机制和生理功能，揭示脂滴与线粒体之间的相互作用关系，以及这些相互作用对细胞能量代谢平衡的调控，揭示自吞噬性溶酶体再生以自吞噬性线粒体降解的分子机制，深入研究核膜融合以及核孔复合体装配的分子基础和机理，揭示生物膜动态变化对细胞TGFβ和Wnt信号通路的调控作用，鉴定一批新的膜蛋白和参与生物膜动态变化的调节分子，获得一批原创性的成果；（2）在现有的基础上，建立完善的膜生物学和膜蛋白结构与功能研究的平台技术体系，重点加强膜蛋白在离体系统中的功能研究，以多种模式生物为基础建立具有特殊膜形态和膜动态的重要细胞器的分离纯化体系，进一步强化膜结构体外重装和膜蛋白与膜脂体外重组的关键技术，发展和完善膜蛋白质组学的研究平台，并争取实现若干关键技术的自主创新；（3）阐述生物膜结构和功能的异常与发生人类重大疾病的相互关联，针对我国多发的癌症，糖尿病和神经退行性疾病种类，寻找一些以膜蛋白为基础的新药物靶点，获得一批有自主知识产权的研究成果；（4）通过培养博士后和博士研究生，扶植一批在膜生物学和膜蛋白研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，造就一支结构合理、具备攻坚能力的国际先进水平的研究队伍；（5）以研究论文和独立开发的技术成果（专利）的形式公布项目研究成果，五年内争取发表SCI论文80篇，其中包括在影响因子大于5的SCI刊物上发表学术论文40篇左右，力争在国际顶级水平杂志上发表高水平论文，并申报专利2-3项。三、研究方案1、学术思路本项目拟依据膜生物学的国际前沿科学问题，选择若干重要方面，结合我们现有的研究基础来探索生物膜动态变化的分子机理，从蛋白质-蛋白质、蛋白质－脂类相互作用，以及生物膜组成成分动态变化分析入手，在分子、细胞器和细胞等多层次上着重阐明生物膜动态变化过程中的分子机理和信号调控机制。生物膜动态变化过程中的分子机制是本项目的核心科学问题，涉及重要膜蛋白及复合体的功能研究，需要膜蛋白质组学发现并鉴定新的相关蛋白，也涉及膜脂与膜蛋白的相互作用机制。本项目将重点揭示生物膜动态变化与细胞信号转导、物质运输、能量代谢、细胞增殖分化、物质与细胞器回收利用等方面的关系及其相关分子机制，从六个不同的角度展开联合攻关：生物膜转运及其调控机制的研究（课题1），生物膜形态发生及维持的分子机制（课题2），生物膜组成成分的动态变化分析（课题3），生物膜的动态循环与自吞噬调控（课题4），核膜的动态变化与细胞增殖调控（课题5），生物膜动态变化对信号转导的调控（课题6）。2、技术途径(1)本项目将采取多学科相互交叉、渗透和有机结合的途径，重点围绕生物膜动态变化、物质运输、膜脂与膜蛋白相互作用,蛋白与蛋白相互作用等膜生物学研究中关键的科学问题，结合膜蛋白质组学等关键技术，系统地开展生物膜和膜蛋白国际前沿领域的基础研究。(2)在多种的空间尺度上研究细胞膜及膜蛋白的结构与功能,包括整体、细胞、细胞器、分子。在整体水平，将采用基因敲除鼠和转基因鼠线虫，及yeast研究细胞膜及膜蛋白的功能；在细胞水平研究生物膜的动态变化以及膜蛋白的定位、功能和相互作用网络等；在细胞器水平，研究膜结构形成、膜转运、细胞器相互作用；在分子水平，研究重要膜蛋白组成与功能的调控机理；膜脂质的组成，及膜脂质与膜蛋白的相互作用，在结构研究方面，确定膜蛋白复合体组成亚基的空间分布。(3)稳态与动态研究相结合，在不同的时间尺度上研究膜及膜蛋白的功能与结构。应用皮秒、纳秒、微秒及毫秒等光谱技术，实时监控膜及膜蛋白的表现行为和相互作用的动力学特性；在不同的时间尺度上研究细胞器行为的动力学特性，包括形成、变化、运动及相互作用。(4)离体(invitro)和在体(invivo)研究相结合。将研究的膜结构分离、纯化，重组进行离体功能研究。将研究的膜蛋白分离、纯化或者表达，重组到脂质体上进行离体功能研究，也要研究这些膜蛋白在动物或细胞活体中的功能，使离体与在体研究相统一。(5)个体膜蛋白研究与膜蛋白质组学研究相结合。通过膜蛋白质组学系统地研究和发现重要功能的膜蛋白及膜蛋白复合物，再针对个体膜蛋白进行深入的功能与结构研究；或者基于对个体膜蛋白功能与结构的深入了解，研究蛋白与蛋白的相互作用，建立与之相互作用的蛋白质相互作用网络。(6)功能与结构的研究紧密结合。膜蛋白功能的研究紧密围绕与囊泡运输、胞吞胞吐、核膜的动态变化、膜结构形成、细胞器相互作用、跨膜信号转导等重要细胞生命活动，膜蛋白结构的研究配合膜蛋白功能进行，膜蛋白功能调控的分子机理的阐明最终需要膜蛋白结构研究提供的结构信息，两者互相促进。3、创新点与特色(1)聚焦国际前沿科学问题是本项目的主要创新点。本项目的选题重点围绕生物膜动态变化与膜功能的相互调节这一关键科学问题，从两个不同方向和层次展开研究：一是探索生物膜动态变化的过程和机理；二是研究生物膜动态变化对细胞生命活动的影响。这两个方向的研究在国际上都处于发展阶段，很多具体的机制仍有待阐明，具有很大的创新空间。在本项目的几个具体研究内容，例如生物膜的转运、内膜精细的结构形成、内膜系统相互作用、细胞自吞噬、核膜动态变化、生物膜动态变化对细胞信号通路的调控等，